Пестыцыды адыгрываюць вырашальную ролю ў вырашэнні праблемы глабальнага дэфіцыту прадуктаў харчавання і барацьбе з трансмісіўнымі захворваннямі чалавека. Аднак, расце праблема ўстойлівасці да пестыцыдаў тэрмінова патрабуе адкрыцця новых злучэнняў, якія накіраваны на недастаткова выкарыстоўваныя мішэні. Каналы патэнцыялу транзіентных рэцэптараў насякомых (TRPV) — Nanzhong (Nan) і неактыўныя (Iav) — могуць утвараць гетэралагічныя каналы (Nan-Iav) і лакалізавацца ў механасенсорных органах, якія апасродкуюць геатрапізм, слых і прапрыяцэпцыю ў насякомых. Некаторыя пестыцыды, такія як афідапіралідон (AP), нацэльваюцца на Nan-Iav праз невядомыя механізмы. AP эфектыўны супраць колюча-смактальных насякомых (Hemiptera), прадухіляючы кармленне, парушаючы функцыю нітак. AP можа звязвацца толькі з Nan, але толькі Nan-Iav можа ўзаемадзейнічаць з аганістамі, у тым ліку з эндагенным нікацінамідам (NAM), тым самым праяўляючы актыўнасць каналаў. Нягледзячы на патэнцыял Nan-Iav як мішэні для інсектыцыдаў, мала што вядома пра яго зборку каналаў, рэгуляторныя сайты звязвання і Ca2+-залежную рэгуляцыю, што перашкаджае далейшай распрацоўцы інсектыцыдаў. У гэтым даследаванні крыяэлектронная мікраскапія была выкарыстана для вызначэння структуры Nan-Iav у насякомых сямейства Hemiptera ў стане без ліганда кальмадуліну, а таксама з AP і NAM на мяжы цытаплазматычнага дамена анкірынавых паўтораў (ARD). Дзіўна, але мы выявілі, што сам бялок Nan можа ўтвараць пентамер, які стабілізуецца AP-апасродкаванымі ARD узаемадзеяннямі. Гэта даследаванне раскрывае малекулярныя ўзаемадзеянні паміж інсектыцыдамі і аганістамі і Nan-Iav, падкрэсліваючы важнасць ARD у функцыянаванні і зборцы каналаў, а таксама даследуючы механізм рэгуляцыі Ca2+.
На фоне ўсё больш сур'ёзных глабальных кліматычных змен пагаршэнне глабальнай харчовай бяспекі з'яўляецца адной з галоўных праблем 21-га стагоддзя з каскаднымі наступствамі для грамадства.1,2Згодна з дакладам Сусветнай арганізацыі аховы здароўя «Стан харчовай бяспекі і харчавання ў свеце за 2023 год» (SOFI), прыблізна 2,33 мільярда чалавек ва ўсім свеце пакутуюць ад умеранай і цяжкай харчовай няўпэўненасці, што з'яўляецца даўняй праблемай.3,4На жаль, паводле ацэнак, штогод з-за шкоднікаў і патагенаў губляецца ад 20% да 30% і больш ураджайнасці сельскагаспадарчых культур, і чакаецца, што глабальнае пацяпленне пагоршыць устойлівасць да шкоднікаў і ўразлівасць сельскагаспадарчых культур.4, 5, 6, 7, 8Распрацоўка пестыцыдаў мае вырашальнае значэнне не толькі для абароны сельскагаспадарчых культур ад шкоднікаў і скарачэння распаўсюджвання трансмісійных патагенаў, але і для барацьбы з трансмісійнымі захворваннямі чалавека, такімі як ліхаманка денге, малярыя і хвароба Шагаса, якія становяцца ўсё больш устойлівымі да пестыцыдаў.5, 9, 10, 11
Сярод асноўных мішэняў нейратаксічных інсектыцыдаў гетэратэтрамерны TRPV-канал Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) прадстаўляе клас інсектыцыдных мішэняў, адкрытых толькі ў апошняе дзесяцігоддзе, у тым ліку камерцыйна даступныя інсектыцыды, такія як імідаклапрыд і піракластрабін.12, 13, 14Паўсінтэтычны інсектыцыд афідапіраліфен (АП) — гэта нядаўна распрацаваны і камерцыялізаваны прадукт, асноўным кампанентам якога з'яўляецца актыўны інсектыцыд Inscalis®, які звязвае АП з субнанамалярным узроўнем актыўнасці.15АП праяўляе нізкую вострую таксічнасць для апыляльнікаў, карысных насякомых і іншых немэтавых арганізмаў, і пры выкарыстанні ў адпаведнасці з інструкцыямі на этыкетцы можа знізіць рэзістэнтнасць да іншых інсектыцыдаў.16, 17, 18Nan і Iav шырока распаўсюджаныя сярод відаў насякомых, сумесна экспрэсуюцца толькі ў нейронах рэцэптараў расцяжэння хордаў вусікаў і канечнасцяў і маюць вырашальнае значэнне для слыху, успрымання гравітацыі і прапрыяцэпцыі.13, 16, 19, 20, 21, 22АП, імідаклапрыд і піракластрабін стымулююць комплекс Nan-Iav праз унікальны механізм, у канчатковым выніку інгібіруючы прапрыяцэптыўную сігнальную трансдукцыю.13, 16, 23У колюча-смактальных насякомых (паўчалавек), такіх як тля і белакрылка, страта прапрыяцэпцыі пагаршае іх здольнасць харчавацца, што ў канчатковым выніку прыводзіць да смерці.13,24Цікава, што AP праяўляе высокую афіннасць да комплексу Nan-Iav і нізкую афіннасць да аднаго Nan. Звязванне AP з Nan-Iav індукуе электрычны ток, але звязванне толькі з Nan не стымулюе актыўнасць канала. Сам Iav зусім не звязваецца з AP.16Гэта сведчыць аб тым, што Nan і Iav могуць звязвацца, утвараючы розныя комплексы каналаў Nan-Iav (напрыклад, з рознымі стехіаметрычнымі суадносінамі або рознымі размяшчэннямі ў межах аднаго стехіаметрычнага суадносін), або што AP можа звязвацца з некалькімі сайтамі. Акрамя таго, натуральны аганістычны нікацінамід (NAM) звязваецца з Nan-Iav дразафілы з мікрамолярнай афіннасцю, праяўляючы эфекты, падобныя да эфектаў тлі (AP) in vitro.16,25і перашкаджаючы размнажэнню і харчаванню тлі, што ў канчатковым выніку прыводзіць да яе гібелі25,26Гэтыя дадзеныя выклікаюць шмат пытанняў. Напрыклад, застаецца незразумелым, як утвараецца гетэрадымер Nan-Iav, якія сайты звязвання выкарыстоўваюцца для мадуляцыі малых малекул і як гэтыя малыя малекулы рэгулююць функцыю канала, падаўляючы прапрыяцэпцыю. Акрамя таго, застаюцца незразумелымі прычыны, па якіх сам Nan неактыўны і мае нізкую афіннасць да AP, у той час як гетэрадымер Nan-Iav актыўны і звязваецца з AP з большай афіннасцю. Нарэшце, мала што вядома пра Ca2+-залежную рэгуляцыю функцыі Nan-Iav і пра тое, як яна інтэгруецца ў працэсы нейрональнай сігналізацыі.13,21
У гэтым даследаванні, спалучаючы крыяэлектронную мікраскапію, электрафізіялогію і метады звязвання радыелігандаў, мы высветлілі зборку Nan-Iav і механізм яго звязвання з рэгулятарамі малых малекул. Акрамя таго, мы выявілі канстытутыўна звязаны кальмадулін (CaM) з Iav і пентамерамі Nan, стабілізаванымі AP. Гэтыя вынікі даюць важнае разуменне рэгуляцыі іонаў кальцыя ў каналах, зборкі каналаў і фактараў, якія вызначаюць афіннасць звязвання ліганда. Што яшчэ больш важна, мы пацвердзілі, што ARD гуляе цэнтральную ролю ў гэтых працэсах. Наша даследаванне поўных каналаў насякомых, звязаных з адпаведнымі сельскагаспадарчымі пестыцыдамі.27, 28, 29адкрывае перспектывы для развіцця пестыцыднай прамысловасці, паляпшаючы эфектыўнасць і спецыфічнасць пестыцыдаў, а таксама дазваляючы ўжываць злучэнні, накіраваныя на TRPV, да іншых відаў для вырашэння глабальнай харчовай бяспекі і распаўсюджвання трансмісійных хвароб.
Мы таксама выявілі, што Nan-Iav рэгулюецца Ca2+, а механізм рэгуляцыі апасродкаваны канстытутыўна звязаным CaM. Важна адзначыць, што гэтая Ca2+-залежная рэгуляцыя Nav з дапамогай CaM істотна адрозніваецца ад механізмаў рэгуляцыі іншых іённых каналаў (напрыклад, напружаннезалежных Na+ каналаў і TRPV5/6 каналаў).52, 53, 54, 55, 56, 57У канале Nav1.2 C-канцавы дамен CaM спіральна звязваецца з C-канцавым даменам (CTD), і Ca2+ індукуе звязванне свайго N-канцавога дамена з дыстальнай часткай CTD.56У канале TRPV5/6 C-канцавы дамен CaM звязваецца з CTH, і Ca2+ індукуе пашырэнне свайго N-канцавога дамена ўверх у пору, тым самым блакуючы пранікальнасць катыёнаў.53,54Мы прапануем мадэль для Ca2+-рэгуляванай функцыі Nan-Iav-CaM (мал. 4h). У гэтай мадэлі N-канцавы дамен CaM канстытутыўна звязваецца з C-канцавым даменам (CTH) Iav. У стане спакою (нізкая канцэнтрацыя [Ca2+]) C-канцавы дамен CaM узаемадзейнічае з Nan, стабілізуючы канфармацыю ARD і тым самым спрыяючы адкрыццю канала. Звязванне агоніста/інсектыцыду з каналам выклікае адкрыццё пор, што прыводзіць да прытоку Ca2+. Затым Ca2+ звязваецца з CaM, выклікаючы дысацыяцыю C-канцавога дамена ад ARD Nan. Паколькі блакаванне звязвання CaM па сутнасці ліквідуе інгібіруючы эфект Ca2+, гэтая дысацыяцыя мадулюе рухомасць ARD, тым самым выклікаючы Ca2+-залежнае інгібіраванне або дэсенсібілізацыю. Хуткае аднаўленне токаў канала пасля элюцыі іонаў кальцыя (мал. 4g) сведчыць аб тым, што гэты механізм спрыяе хуткім рэакцыям на Ca2+-апасродкаваныя нейрональныя сігналы. Акрамя таго, паведамлялася, што С-канцавая вобласць Iav, якая застаецца малавывучанай, адыгрывае іншыя ролі ў таргетынгу каналаў і рэгуляцыі току.21
Нарэшце, у нашым даследаванні прадстаўлена высокаразрозная структура комплексу інсектыцыд-інсектыцыдных TRP-каналаў сельскагаспадарчага значэння — адкрыццё, якое раней нам было невядомае. Прыкметна, што мы ахарактарызавалі структуру і функцыю канала насякомых у клетках чалавека (HEK293S GnTi–), а не ў клетках насякомых. Ва ўмовах росту ўстойлівасці да інсектыцыдаў і пастаяннага ціску на харчовую бяспеку і патагены, наша праца дае важную інфармацыю, якая будзе спрыяць распрацоўцы новых інсектыцыдаў на карысць здароўя чалавека і глабальнай харчовай бяспекі. Даследаванні паказалі, што інсектыцыды, такія як AP, эфектыўныя супраць некаторых шкоднікаў пры выкарыстанні ў адпаведнасці з інструкцыямі на этыкетцы і маюць нізкую вострую таксічнасць для карысных апыляльнікаў, што сведчыць аб іх экалагічнай бяспецы.13,16Акрамя таго, выпрабаванні некаторых вытворных AP на камарах паказалі, што яны з часам губляюць здольнасць лётаць. Разуменне таго, як гэтыя мадулюючыя злучэнні звязваюцца з Nan-Iav, будзе спрыяць мадыфікацыі існуючых злучэнняў або распрацоўцы новых злучэнняў для больш эфектыўнага ідакладныбарацьба са шкоднікамі. Наша даследаванне паказвае, што інтэрфейс Nan-Iav ARD мае вырашальнае значэнне не толькі для рэгулявання актыўнасці эндагенных злучэнняў, пестыцыдаў і Ca2+-CaM, але і для зборкі каналаў. Мы мяркуем, што парушэнне зборкі гетэрадымераў з дапамогай малых малекул можа быць унікальным і перспектыўным падыходам да распрацоўкі інгібітараў іённых каналаў.
З васьмі арталагічных генаў былі адабраны паўнавартасныя гены бурага жука (Halyomorpha halys) Nanchung і Inactive, якія прадэманстравалі выдатную стабільнасць у дэтэргентах. Сінтэзаваныя гены былі аптымізаваны па кодонах для экспрэсіі ў чалавека і кланіраваны ў вектар pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) з выкарыстаннем сайтаў рэстрыкцыі XhoI і EcoRI. Гэта гарантавала, што клоны знаходзяцца ў рамцы з C-канцавымі меткамі GFP-FLAG-10xHis і mCherry-FLAG-10xHis, якія расшчапляюцца пратэазай HRC-3C (PPX), што дазваляе незалежна...выразПраймеры, якія выкарыстоўваліся для кланавання Nanchung і Inactive ў вектар pBacMam, былі наступнымі:
Мікраскапічныя выявы асобных часціц былі атрыманы з дапамогай прасвечвальнага электроннага мікраскопа Titan Krios G2 (FEI), абсталяванага камерай K3 і энергетычным фільтрам Gatan BioQuantum. Мікраскоп працаваў пры энергіі 300 кэВ, з энергетычнай устаноўкай 20 эВ, памерам пікселя ўзору 1,08 Å/піксель (намінальнае павелічэнне 81 000x) і градыентам дэфакусоўкі ад -0,8 да -2,2 мкм. Відэазапіс праводзіўся з частатой 40 кадраў у секунду з выкарыстаннем мікраскопа Latitude S (Gatan) з намінальнай магутнасцю дозы 25 e–px−1 s−1, часам экспазіцыі 2,4 с і агульнай дозай прыблізна 60 e–Å−2.
Карэкцыя руху, выкліканага прамянём, і дозавая вага былі выкананы на плёнцы з выкарыстаннем MotionCor2 у RELION 4.061. Ацэнка параметраў функцыі перадачы кантрасту (CTF) была выканана ў cryoSPARC з выкарыстаннем метаду ацэнкі CTF на аснове патчаў62. Фотамікрафатаграфіі з дазволам апраксімацыі CTF ≥4 Å былі выключаны з наступнага аналізу. Як правіла, падмноства з 500–1000 фотамікрафатаграфій выкарыстоўвалася для кропкавага выбару ў cryoSPARC, а затым некалькі разоў пасля фільтрацыі праводзілася 2D-класіфікацыя для атрымання выразнага эталоннага малюнка для выбару часціц на аснове шаблону. Затым часціцы былі выняты з выкарыстаннем 64-піксельных абмежавальных рамак і 4-кратнага бінінгу. Было выканана некалькі этапаў 2D-класіфікацыі для выдалення непажаданых катэгорый часціц. Пачатковая 3D-мадэль была рэканструявана з выкарыстаннем ab initio рэканструкцыі і ўдакладнена з выкарыстаннем нераўнамернага ўдакладнення ў cryoSPARC. 3D-класіфікацыя была выканана ў cryoSPARC або RELION на аснове гетэрагеннасці ARD. Істотнай гетэрагеннасці мембранных даменаў не назіралася. Часціцы былі ўдакладнены з выкарыстаннем метадаў C1 і C2; Часціцы з больш высокім разрозненнем C2 лічыліся сіметрычнымі адносна C2 і імпартавалі ў RELION для байесаўскага ўдакладнення. Затым часціцы былі перададзены назад у cryoSPARC для канчатковага неаднароднага і лакальнага ўдакладнення. Канчатковае разрозненне і колькасць часціц паказаны ў табліцы 1.
Пры апрацоўцы пентамераў Nan+AP мы даследавалі розныя метады паляпшэння раздзяляльнай здольнасці мембранных даменаў (асабліва вобласці пор), такія як адніманне сігналаў і маскіроўка TMD. Аднак гэтыя спробы былі няўдалымі з-за патэнцыйна экстрэмальнай неўпарадкаванасці ў вобласці пор і агульнай неаднароднасці TMD. Канчатковая раздзяляльная здольнасць была разлічана з выкарыстаннем маскі, аўтаматычна згенераванай метадам нераўнамернай апрацоўкі ў cryoSPARC, у першую чаргу накіраванай на вобласць ARD. Гэта дасягнула значна больш высокай раздзяляльнай здольнасці, чым у мембранных даменаў (асабліва вобласці VSLD).
Пачатковыя de novo мадэлі апо-формаў блакад Nanchung і Inactive былі спачатку створаны з выкарыстаннем Coot63, а мадэлі блакад Nan і Iav былі створаны з выкарыстаннем AlphaFold264 для ідэнтыфікацыі абласцей з нізкай дакладнасцю. Мадэляванне кальмадуліну было заснавана на апраксімацыі цвёрдацельных структур мадэляў звязвання Ca2+ і без Ca2+ у PDB-даступах 4JPZ56 і 1CFD65 адпаведна. Мадэлі былі ўдакладнены з выкарыстаннем сферычнага ўдакладнення, каб забяспечыць правільную стэрэахімію і добрую геаметрыю. Затым фасфатыдылхалін, фасфатыдылэтаноламін і фасфатыдылсерын былі мадэляваны як добра акрэсленыя шчыльнасці ліпідаў, а ліганды NAM і AP былі размешчаны ў адпаведных шчыльнасцях у шчыльных злучэннях. Файлы абмежаванняў былі створаны з радка SMILES ізаформ з выкарыстаннем eLBOW у PHENIX66. Нарэшце, мадэлі былі ўдакладнены ў рэальнай прасторы ў PHENIX з выкарыстаннем лакальнага пошуку па сетцы і глабальнай мінімізацыі з абмежаваннямі другаснай структуры. Для ўдасканалення мадэлі і структурнага аналізу выкарыстоўваўся сервер MolProbity, а ілюстрацыі былі выкананы з выкарыстаннем PyMOL і UCSF Chimera X.67,68,69 Аналіз апертуры быў выкананы з выкарыстаннем сервера HOLE,70 а карта захавання паслядоўнасці — з выкарыстаннем сервера Consurf.71
Статыстычны аналіз быў праведзены з выкарыстаннем праграм Igor Pro 6.2, Excel Office 365 і GraphPad Prism 7.0. Усе колькасныя дадзеныя прадстаўлены ў выглядзе сярэдняга значэння ± стандартная памылка (SEM). Для параўнання дзвюх груп выкарыстоўваўся t-крытэрый Стьюдэнта (двухбаковы, няпарны). Для параўнання некалькіх груп выкарыстоўваўся аднафактарны дысперсійны аналіз (ANOVA) з наступным post hoc крытэрыем Данэта. *P< 0,05, **P< 0,01 і ***P< 0,001 лічыліся статыстычна значнымі ў залежнасці ад размеркавання дадзеных. Значэнні Kd, Ki і іх асіметрычныя 95% даверныя інтэрвалы былі разлічаны з дапамогай GraphPad Prism 10.
Больш падрабязную інфармацыю аб метадалогіі даследавання можна знайсці ў кароткім зместы справаздачы аб партфоліа прыроды, спасылка на які змяшчаецца ў гэтым артыкуле.
Пачатковая мадэль была пабудавана з выкарыстаннем мадэляў кальмадуліну з баз дадзеных PDB 4JPZ і 1CFD. Каардынаты былі занесены ў банк даных аб бялках (PDB) пад нумарамі 9NVN (Nan-Iav-CaM без ліганда), 9NVO (Nan-Iav-CaM, звязаны з нікацінамідам), 9NVP (Nan-Iav-CaM, звязаны з нікацінамідам і ЭДТА), 9NVQ (Nan-Iav-CaM, звязаны з афенідолпіролінам і кальцыем), 9NVR (Nan-Iav-CaM, звязаны з афенідолпіролінам і ЭДТА) і 9NVS (пентамер Nan, звязаны з афенідолпіролінам). Адпаведныя выявы крыяэлектроннай мікраскапіі захоўваюцца ў базе дадзеных электроннай мікраскапіі (EMDB) пад наступнымі рэгістрацыйнымі нумарамі: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM без ліганда), EMD-49845 (комплекс Nan-Iav-CaM з нікацінамідам), EMD-49846 (комплекс Nan-Iav-CaM з нікацінамідам і ЭДТА), EMD-49847 (комплекс Nan-Iav-CaM з афідапіралінам і кальцыем), EMD-49848 (комплекс Nan-Iav-CaM з афідапіралінам і ЭДТА) і EMD-49849 (пентамерны комплекс Nan з афідапіралінам). Неапрацаваныя дадзеныя для функцыянальнага аналізу прадстаўлены ў гэтай працы.
Час публікацыі: 28 студзеня 2026 г.