Глістагонны прэпарат N,N-диэтил-м-толуамид (ДЫТ), як паведамляецца, інгібіруе AChE (ацэтылхалінэстэразу) і мае патэнцыйныя канцэрагенныя ўласцівасці з-за празмернай васкулярызацыі. У гэтым артыкуле мы паказваем, што DEET спецыяльна стымулюе эндотелиальные клеткі, якія спрыяюць ангіягенезу, тым самым павялічваючы рост пухліны. DEET актывуе клеткавыя працэсы, якія вядуць да ангіягенезу, уключаючы праліферацыю, міграцыю і адгезію. Гэта звязана з павелічэннем выпрацоўкі NO і экспрэсіі VEGF ў эндотелиальных клетках. Прыглушэньне М3 або выкарыстаньне фармакалягічных інгібітараў М3 ліквідавала ўсе гэтыя эфэкты, што сьведчыць пра тое, што ангіягенэз, выкліканы DEET, адчувальны да М3. Эксперыменты з удзелам перадачы сігналаў кальцыя ў эндотелиальных клетках і клетках HEK, якія падвышана экспрэсуюць рэцэптары М3, а таксама даследаванні звязвання і стыкоўкі паказваюць, што DEET дзейнічае як алластэрычны мадулятар рэцэптараў М3. Акрамя таго, DEET інгібіруе AChE, тым самым павялічваючы біялагічную даступнасць ацэтылхаліну і яго звязванне з рэцэптарамі M3, а таксама ўзмацняючы праангіягенныя эфекты праз алластэрычную рэгуляцыю.
Першасныя ЭК былі вылучаныя з аорты швейцарскіх мышэй. Метад экстракцыі быў адаптаваны з пратакола Кабаяшы 26 . Мышыныя ЭК культывавалі ў асяроддзі EBM-2, дапоўненай 5% інактываванай цяплом FBS, да чацвёртага пасажу.
Уплыў дзвюх канцэнтрацый DEET на праліферацыю HUVEC, U87MG або BF16F10 быў прааналізаваны з дапамогай набору для аналізу праліферацыі клетак CyQUANT (малекулярныя зонды, C7026). Карацей кажучы, 5,103 клетак на лунку высейвалі ў 96-лункавы пласціну, давалі прымацаваць на ноч, а затым апрацоўвалі DEET на працягу 24 гадзін. Пасля выдалення асяроддзя росту дадайце раствор для звязвання фарбавальніка ў кожную лунку мікрапланшата і інкубуйце клеткі пры 37 °C на працягу 30 хвілін. Узроўні флуарэсцэнцыі вызначалі з дапамогай шматмодавага счытвальніка мікрапланшэтаў Mithras LB940 (Berthold Technologies, Бад-Вільбад, Германія), абсталяванага фільтрамі ўзбуджэння 485 нм і фільтрамі выпраменьвання 530 нм.
HUVEC высейвалі ў 96-лункавыя пласціны пры шчыльнасці 104 клетак на лунку. Клеткі апрацоўвалі DEET на працягу 24 гадзін. Жыццяздольнасць клетак ацэньвалі з дапамогай каларыметрычнага аналізу MTT (Sigma-Aldrich, M5655). Значэнні аптычнай шчыльнасці былі атрыманы на шматмодавым рыдэры для мікрапланшэтаў (Mithras LB940) пры даўжыні хвалі 570 нм.
Эфекты DEET вывучаліся з дапамогай аналізаў ангіягенезу in vitro. Апрацоўка 10-8 М або 10-5 М DEET павялічыла адукацыю даўжыні капіляраў у HUVEC (мал. 1а, б, белыя палоскі). У параўнанні з кантрольнай групай лячэнне канцэнтрацыямі DEET у дыяпазоне ад 10-14 да 10-5 М паказала, што даўжыня капіляра дасягнула плато пры 10-8 М DEET (дадатковы малюнак S2). Не было выяўлена істотнай розніцы ў праангіягенным эфекце in vitro HUVEC, апрацаваных DEET у дыяпазоне канцэнтрацый 10-8 М і 10-5 М.
Каб вызначыць уплыў DEET на неоваскуляризацию, мы правялі даследаванні неоваскуляризации in vivo. Праз 14 дзён мышам, якім ўводзілі эндотелиальные клеткі, папярэдне культываваныя з 10-8 М або 10-5 М DEET, паказалі значнае павелічэнне ўтрымання гемаглабіну (мал. 1с, белыя палоскі).
Акрамя таго, DEET-індукаваная неоваскуляризация была вывучана на мышах з ксенотрансплантатом U87MG, якім штодня ўводзілі (IP) DEET у дозе, якая, як вядома, выклікае канцэнтрацыі ў плазме 10-5 М, што з'яўляецца нармальным для людзей, якія падвергліся ўздзеянню. у 23. Выяўленыя пухліны (г.зн. пухліны >100 мм3) назіраліся праз 14 дзён пасля ін'екцыі клетак U87MG мышам. На 28-ы дзень рост пухліны значна павялічыўся ў мышэй, якія атрымлівалі DEET, у параўнанні з кантрольнымі мышамі (мал. 1d, квадраты). Акрамя таго, афарбоўванне пухлін CD31 паказала, што DEET значна павялічвае плошчу капіляраў, але не шчыльнасць мікрасасудаў. (Мал. 1e–g).
Для вызначэння ролі мускариновых рэцэптараў у індукаванай ДЭТА праліферацыі выкарыстоўвалі 10-8 М або 10-5 М ДЭТА ў прысутнасці pFHHSiD (10-7 М, селектыўны антаганіст рэцэптараў М3). Лячэнне HUVEC. pFHHSiD цалкам блакаваў праліфератыўныя ўласцівасці ДЭТА ва ўсіх канцэнтрацыях (табл. 1).
У гэтых умовах мы таксама вывучылі, ці павялічыць DEET даўжыню капіляраў у клетках HUVEC. Аналагічным чынам pFHHSiD істотна прадухіляў DEET-індукаваны даўжыню капіляраў (мал. 1a, b, шэрыя палоскі). Акрамя таго, падобныя эксперыменты былі праведзены з M3 siRNA. Нягледзячы на тое, што кантрольная миРНК была неэфектыўнай у садзейнічанні адукацыі капіляраў, прыглушэнне мускаринового рэцэптара М3 адмяніла здольнасць DEET павялічваць даўжыню капіляраў (мал. 1а, б, чорныя палосы).
Акрамя таго, як 10-8 М або 10-5 М DEET-індукаваная васкуляризация in vitro, так і неоваскуляризация in vivo былі цалкам заблакаваныя pFHHSiD (мал. 1c, d, кругі). Гэтыя вынікі паказваюць, што DEET спрыяе ангіягенезу праз шлях, адчувальны да селектыўных антаганістаў рэцэптараў M3 або siRNA M3.
AChE з'яўляецца малекулярнай мішэнню DEET. Такія прэпараты, як донепезіл, якія дзейнічаюць як інгібітары AChE, могуць стымуляваць ангіягенез EC in vitro і на мадэлях ішэміі задніх канечнасцяў мышэй14. Мы пратэставалі ўплыў двух канцэнтрацый DEET на актыўнасць фермента AChE ў HUVEC. Нізкія (10-8 М) і высокія (10-5 М) канцэнтрацыі DEET зніжалі актыўнасць АХЭ эндатэлю ў параўнанні з кантрольнымі ўмовамі (мал. 2).
Абедзве канцэнтрацыі DEET (10-8 М і 10-5 М) зніжаюць актыўнасць ацэтылхалінэстэразы на HUVEC. BW284c51 (10-5 М) выкарыстоўвалі ў якасці кантролю для інгібітараў ацэтылхалінэстэразы. Вынікі выяўляюцца ў працэнтах ад актыўнасці AChE на HUVEC, апрацаваных двума канцэнтрацыямі DEET, у параўнанні з клеткамі, апрацаванымі сродкам. Значэнні выяўляюцца як сярэдняе ± SEM шасці незалежных эксперыментаў. *p <0,05 у параўнанні з кантролем (тэст множнага параўнання Краскала-Уоліса і Данна).
Аксід азоту (NO) удзельнічае ў ангіягенным працэсе 33, таму вывучалася выпрацоўка NO ў HUVEC, стымуляваных DEET. Выпрацоўка DEET эндатэлю NO была павялічана ў параўнанні з кантрольнымі клеткамі, але дасягнула значнасці толькі ў дозе 10-8 М (мал. 3c). Каб вызначыць малекулярныя змены, якія кантралююць выпрацоўку NO, выкліканую DEET, экспрэсія і актывацыя eNOS былі прааналізаваны з дапамогай вестэрн-блоттинга. Нягледзячы на тое, што лячэнне DEET не змяніла экспрэсію eNOS, яно значна павялічыла фасфараляванне eNOS у месцы яго актывацыі (Ser-1177), адначасова паменшыўшы яго інгібіруючы сайт (Thr-495) у параўнанні з неапрацаванымі клеткамі ў фасфараляванні eNOS (мал. 3d). Акрамя таго, стаўленне фасфарыляванага eNOS у месцы актывацыі і інгібіруючага сайта было разлічана пасля нармалізацыі колькасці фасфарыляванага eNOS да агульнай колькасці фермента. Гэта стаўленне было значна павялічана ў HUVECs, апрацаваных кожнай канцэнтрацыяй DEET у параўнанні з неапрацаванымі клеткамі (мал. 3d).
Нарэшце, экспрэсія VEGF, аднаго з асноўных проангиогенных фактараў, была прааналізавана Вестэрн-блоттингом. DEET значна павялічыў экспрэсію VEGF, тады як pFHHSiD цалкам блакаваў гэтую экспрэсію.
Паколькі эфекты DEET адчувальныя як да фармакалагічнай блакады, так і да паніжэння рэгуляцыі рэцэптараў М3, мы праверылі гіпотэзу аб тым, што DEET можа ўзмацніць сігналізацыю кальцыя. Дзіўна, але DEET не ўдалося павялічыць цытаплазматычны кальцый у HUVEC (дадзеныя не паказаны) і HEK/M3 (мал. 4a, b) для абедзвюх выкарыстоўваных канцэнтрацый.
Час публікацыі: 30 снежня 2024 г