Супрацьгельмінтны прэпарат N,N-дыэтыл-м-талуамід (ДЭТА) як паведамлялася, інгібіруе АХЭ (ацэтылхалінестэразу) і мае патэнцыйныя канцэрагенныя ўласцівасці з-за празмернай васкулярызацыі. У гэтай працы мы паказваем, што ДЭТА спецыфічна стымулюе эндатэліяльныя клеткі, якія спрыяюць ангіягенезу, тым самым павялічваючы рост пухліны. ДЭТА актывуе клеткавыя працэсы, якія прыводзяць да ангіягенезу, у тым ліку праліферацыю, міграцыю і адгезію. Гэта звязана з павелічэннем прадукцыі NO і экспрэсіі VEGF у эндатэліяльных клетках. Прыглушэнне М3 або выкарыстанне фармакалагічных інгібітараў М3 ліквідуе ўсе гэтыя эфекты, што сведчыць аб тым, што ангіягенез, выкліканы ДЭТА, адчувальны да М3. Эксперыменты, якія ўключаюць кальцыевую сігналізацыю ў эндатэліяльных і HEK-клетках, якія звышэкспрэсуюць рэцэптары М3, а таксама даследаванні звязвання і дакінгу, паказваюць, што ДЭТА дзейнічае як аластэрычны мадулятар рэцэптараў М3. Акрамя таго, ДЭТА інгібіруе АХЭ, тым самым павялічваючы біядаступнасць ацэтылхаліну і яго звязванне з рэцэптарамі М3, а таксама ўзмацняючы праангіягенныя эфекты праз аластэрычную рэгуляцыю.
Першасныя эндакрынных клетак (ЭК) былі вылучаны з аорты швейцарскіх мышэй. Метад экстракцыі быў адаптаваны з пратаколу Кабаяшы26. ЭК мышэй культывавалі ў асяроддзі EBM-2 з даданнем 5% інактываванай цяплом фетальнай бычынай свінкі (ФБС) да чацвёртага пасажу.
Уплыў дзвюх канцэнтрацый ДЭТА на праліферацыю HUVEC, U87MG або BF16F10 аналізавалі з выкарыстаннем набору для аналізу праліферацыі клетак CyQUANT (Molecular Probes, C7026). Карацей кажучы, 5.103 клетак на лунку высейвалі ў 96-лункавы планшэт, пакідалі прымацавацца на ноч, а затым апрацоўвалі ДЭТА на працягу 24 гадзін. Пасля выдалення асяроддзя для росту дадавалі раствор для звязвання фарбавальніка ў кожную лунку мікрапланшэта і інкубавалі клеткі пры тэмпературы 37°C на працягу 30 хвілін. Узроўні флуарэсцэнцыі вызначалі з дапамогай шматмодавага мікрапланшэтнага рыдэра Mithras LB940 (Berthold Technologies, Бад-Вільдбад, Германія), абсталяванага фільтрамі ўзбуджэння 485 нм і фільтрамі выпраменьвання 530 нм.
Энцефалоіды HUVEC высейвалі ў 96-лункавыя планшэты пры шчыльнасці 10⁴ клетак на лунку. Клеткі апрацоўвалі ДЭТА на працягу 24 гадзін. Жыццяздольнасць клетак ацэньвалі з дапамогай каларыметрычнага МТТ-аналізу (Sigma-Aldrich, M5655). Значэнні аптычнай шчыльнасці атрымлівалі на шматмодавым мікрапланшэтным рыдэры (Mithras LB940) пры даўжыні хвалі 570 нм.
Эфекты ДЭТА вывучаліся з дапамогай аналізаў ангіягенезу in vitro. Апрацоўка ДЭТА ў канцэнтрацыях 10⁻⁶ М або 10⁻⁶ М павялічыла ўтварэнне даўжыні капіляраў у HUVEC (мал. 1a, b, белыя слупкі). У параўнанні з кантрольнай групай, апрацоўка ДЭТА ў канцэнтрацыях ад 10⁻⁶ да 10⁻⁶ М паказала, што даўжыня капіляраў дасягнула плато пры 10⁻⁶ М ДЭТА (дадатковы мал. S2). Істотнай розніцы ў праангіягенным эфекце HUVEC, апрацаваных ДЭТА ў дыяпазоне канцэнтрацый 10⁻⁶ М і 10⁻⁶ М, не было выяўлена.
Каб вызначыць уплыў ДЭТА на неаваскулярызацыю, мы правялі даследаванні неаваскулярызацыі in vivo. Праз 14 дзён у мышэй, якім уводзілі эндатэліяльныя клеткі, папярэдне культываваныя з 10⁻⁶ М або 10⁻⁶ М ДЭТА, назіралася значнае павелічэнне ўтрымання гемаглабіну (мал. 1c, белыя слупкі).
Акрамя таго, неаваскулярызацыя, выкліканая ДЭТА, была вывучана ў мышэй з ксенатрансплантатам U87MG, якім штодня (в/б) уводзілі ДЭТА ў дозе, якая, як вядома, індукуе канцэнтрацыі ў плазме 10-5 М, што з'яўляецца нармальным для людзей, якія падвергліся ўздзеянню. у 23. Выяўленыя пухліны (г.зн. пухліны >100 мм3) назіраліся праз 14 дзён пасля ін'екцыі клетак U87MG мышам. На 28-ы дзень рост пухліны значна павялічыўся ў мышэй, якія атрымлівалі ДЭТА, у параўнанні з кантрольнымі мышамі (мал. 1d, квадраты). Акрамя таго, афарбоўванне пухлін на CD31 паказала, што ДЭТА значна павялічвае плошчу капіляраў, але не шчыльнасць мікрасасудаў. (мал. 1e-g).
Для вызначэння ролі мускарынавых рэцэптараў у праліферацыі, выкліканай DETA, выкарыстоўвалі 10⁻⁶ М або 10⁻⁶ М DETA ў прысутнасці pFHHSiD (10⁻⁶ М, селектыўны антаганіст M3-рэцэптараў). Апрацоўка HUVEC pFHHSiD цалкам блакаваў праліфератыўныя ўласцівасці DETA пры ўсіх канцэнтрацыях (табліца 1).
Ва ўмовах, якія мы ўстанавілі, мы таксама даследавалі, ці будзе ДЭТА павялічваць даўжыню капіляраў у клетках HUVEC. Падобным чынам, pFHHSiD значна прадухіляў павелічэнне даўжыні капіляраў, выкліканае ДЭТА (мал. 1a, b, шэрыя слупкі). Акрамя таго, падобныя эксперыменты былі праведзены з M3 siRNA. Нягледзячы на тое, што кантрольная siRNA не была эфектыўнай у стымуляванні ўтварэння капіляраў, заглушэнне мускарынавых рэцэптараў M3 ліквідавала здольнасць ДЭТА павялічваць даўжыню капіляраў (мал. 1a, b, чорныя слупкі).
Акрамя таго, як 10⁻⁶ М або 10⁻⁶ М ДЭТА-індукаваная васкулярызацыя in vitro, так і неаваскулярызацыя in vivo былі цалкам заблакаваны pFHHSiD (мал. 1c, d, кругі). Гэтыя вынікі паказваюць, што ДЭТА спрыяе ангіягенезу праз шлях, адчувальны да селектыўных антаганістаў рэцэптараў М3 або M3 siRNA.
АХЭ з'яўляецца малекулярнай мішэнню ДЭТА. Такія прэпараты, як донепезіл, якія дзейнічаюць як інгібітары АХЭ, могуць стымуляваць ангіягенез эндатэліяльных клетак in vitro і на мадэлях ішэміі задніх канечнасцяў мышэй14. Мы праверылі ўплыў дзвюх канцэнтрацый ДЭТА на актыўнасць фермента АХЭ ў эндатэліяльных клетках HUVEC. Нізкая (10-8 М) і высокая (10-5 М) канцэнтрацыі ДЭТА зніжалі актыўнасць эндатэліяльнай АХЭ ў параўнанні з кантрольнымі ўмовамі (мал. 2).
Абедзве канцэнтрацыі ДЭТА (10⁻⁶ М і 10⁻⁶ М) зніжалі актыўнасць ацэтылхалінестэразы на HUVEC. BW284c51 (10⁻⁶ М) выкарыстоўваўся ў якасці кантролю для інгібітараў ацэтылхалінестэразы. Вынікі выражаны ў працэнтах актыўнасці AChE на HUVEC, апрацаваных дзвюма канцэнтрацыямі ДЭТА, у параўнанні з клеткамі, апрацаванымі носьбітам. Значэнні выражаны як сярэдняе значэнне ± SEM шасці незалежных эксперыментаў. *p < 0,05 у параўнанні з кантролем (тэст множнага параўнання Краскела-Уоліса і Дана).
Аксід азоту (NO) удзельнічае ў ангіягенным працэсе 33, таму вывучалася прадукцыя NO ў стымуляваных DEET эндатэліяльных клетках эндатэлія. Прадукцыя NO эндатэлія, апрацаваная DEET, павялічвалася ў параўнанні з кантрольнымі клеткамі, але дасягала значнасці толькі пры дозе 10-8 М (мал. 3c). Каб вызначыць малекулярныя змены, якія кантралююць індукаваную DEET прадукцыю NO, экспрэсію і актывацыю eNOS аналізавалі з дапамогай вестэрн-блотынгу. Нягледзячы на тое, што апрацоўка DEET не змяніла экспрэсію eNOS, яна значна павялічыла фасфараляванне eNOS у яго актывуючым сайце (Ser-1177), адначасова зніжаючы яго інгібіруючы сайт (Thr-495) у параўнанні з неапрацаванымі клеткамі пры фасфараляванні eNOS (мал. 3d). Акрамя таго, суадносіны фасфараляванай eNOS у месцы актывацыі і інгібіруючым сайце было разлічана пасля нармалізацыі колькасці фасфараляванай eNOS да агульнай колькасці фермента. Гэта суадносіны было значна павялічана ў HUVEC, апрацаваных кожнай канцэнтрацыяй DEET, у параўнанні з неапрацаванымі клеткамі (мал. 3d).
Нарэшце, экспрэсія VEGF, аднаго з асноўных праангіягенных фактараў, была прааналізавана з дапамогай вестэрн-блотынгу. DEET значна павялічыў экспрэсію VEGF, у той час як pFHHSiD цалкам блакаваў гэтую экспрэсію.
Паколькі эфекты ДЭТА адчувальныя як да фармакалагічнай блакады, так і да паніжэння рэгуляцыі М3-рэцэптараў, мы праверылі гіпотэзу аб тым, што ДЭТА можа ўзмацняць кальцыевую сігналізацыю. Дзіўна, але ДЭТА не павялічыў цытаплазматычны кальцый у HUVEC (дадзеныя не паказаны) і HEK/M3 (мал. 4a, b) для абедзвюх выкарыстаных канцэнтрацый.
Час публікацыі: 30 снежня 2024 г.