У гэтым даследаванні стымулюючы эфект камбінаванага лячэннярэгулятары росту раслінБылі даследаваны ўплыў наначасціц (2,4-D і кінетыну) і аксіду жалеза (Fe₃O₄-NPs) на марфагенез in vitro і выпрацоўку другасных метабалітаў у *Hypericum perforatum* L. Аптымізаваная апрацоўка [2,4-D (0,5 мг/л) + кінетын (2 мг/л) + Fe₃O₄-NPs (4 мг/л)] значна палепшыла параметры росту раслін: вышыня раслін павялічылася на 59,6%, даўжыня каранёў — на 114,0%, колькасць пупышак — на 180,0%, а свежая маса калуса — на 198,3% у параўнанні з кантрольнай групай. Гэтая камбінаваная апрацоўка таксама павысіла эфектыўнасць рэгенерацыі (50,85%) і павялічыла ўтрыманне гіперыцыну на 66,6%. Аналіз метадам ГХ-МС выявіў высокае ўтрыманне гіперазіду, β-паталену і цэтылавага спірту, што складае 93,36% ад агульнай плошчы піка, у той час як утрыманне агульных фенольных злучэнняў і флаваноідаў павялічылася на цэлых 80,1%. Гэтыя вынікі паказваюць, што рэгулятары росту раслін (РРР) і наначасціцы Fe₃O₄ (Fe₃O₄-НЧ) аказваюць сінергічны эфект, стымулюючы арганагенез і назапашванне біялагічна актыўных злучэнняў, што ўяўляе сабой перспектыўную стратэгію біятэхналагічнага ўдасканалення лекавых раслін.
Святаяннік (Hypericum perforatum L.), таксама вядомы як святаяннік, — гэта шматгадовая травяністая расліна сямейства святаянніковых, якая мае эканамічную каштоўнасць.[1] Яе патэнцыйныя біялагічна актыўныя кампаненты ўключаюць натуральныя таніны, ксантаны, флораглюцынол, нафталіндыантрон (гіперын і псеўдагіперын), флаваноіды, фенольныя кіслоты і эфірныя алеі.[2,3,4] Святаяннік можна размнажаць традыцыйнымі метадамі; аднак сезоннасць традыцыйных метадаў, нізкая ўсходжасць насення і ўспрымальнасць да хвароб абмяжоўваюць яго патэнцыял для маштабнага культывавання і бесперапыннага ўтварэння другасных метабалітаў.[1,5,6]
Такім чынам, культываванне тканін in vitro лічыцца эфектыўным метадам хуткага размнажэння раслін, захавання рэсурсаў зародкавай плазмы і павелічэння ўраджайнасці лекавых рэчываў [7, 8]. Рэгулятары росту раслін (РРР) адыгрываюць вырашальную ролю ў рэгуляванні морфагенезу і неабходныя для культывавання калюса і цэлых арганізмаў in vitro. Аптымізацыя іх канцэнтрацый і камбінацый мае вырашальнае значэнне для паспяховага завяршэння гэтых працэсаў развіцця [9]. Таму разуменне адпаведнага складу і канцэнтрацыі рэгулятараў важна для паляпшэння росту і рэгенератыўнай здольнасці святаянніка (H. perforatum) [10].
Наначасціцы аксіду жалеза (Fe₃O₄) — гэта клас наначасціц, якія былі або распрацоўваюцца для культывавання тканін. Fe₃O₄ валодае значнымі магнітнымі ўласцівасцямі, добрай біясумяшчальнасцю і здольнасцю спрыяць росту раслін і зніжаць уздзеянне навакольнага асяроддзя, таму ён прыцягнуў значную ўвагу ў распрацоўцы культывавання тканін. Патэнцыйныя сферы прымянення гэтых наначасціц могуць уключаць аптымізацыю культывавання in vitro для стымулявання дзялення клетак, паляпшэння паглынання пажыўных рэчываў і актывацыі антыаксідантных ферментаў [11].
Нягледзячы на тое, што наначасціцы прадэманстравалі добры стымулюючы эфект на рост раслін, даследаванняў па сумесным ужыванні наначасціц Fe₃O₄ і аптымізаваных рэгулятараў росту раслін у *H. perforatum* застаецца мала. Каб запоўніць гэты прабел у ведах, у гэтым даследаванні быў ацэнены ўплыў іх сумеснага ўздзеяння на марфагенез in vitro і выпрацоўку другасных метабалітаў, каб даць новыя ідэі для паляпшэння характарыстык лекавых раслін. Такім чынам, гэта даследаванне мае дзве мэты: (1) аптымізаваць канцэнтрацыю рэгулятараў росту раслін для эфектыўнага садзейнічання ўтварэнню калюса, рэгенерацыі парасткаў і ўкараненню in vitro; і (2) ацаніць уплыў наначасціц Fe₃O₄ на параметры росту in vitro. У будучыні планы ўключаюць ацэнку выжывальнасці рэгенераваных раслін падчас акліматызацыі (in vitro). Чакаецца, што вынікі гэтага даследавання значна палепшаць эфектыўнасць мікраразмнажэння *H. perforatum*, тым самым спрыяючы ўстойліваму выкарыстанню і біятэхналагічным прымяненню гэтай важнай лекавай расліны.
У гэтым даследаванні мы атрымалі эксплантаты лісця з аднагадовых раслін святаянніка (мацярынскіх раслін), вырашчаных у палявых умовах. Гэтыя эксплантаты выкарыстоўваліся для аптымізацыі ўмоў культывавання in vitro. Перад культываваннем лісце старанна прамывалі пад праточнай дыстыляванай вадой на працягу некалькіх хвілін. Затым паверхні эксплантатаў дэзінфікавалі, апускаючы іх у 70% этанол на 30 секунд, а затым апускалі ў 1,5% раствор гіпахларыту натрыю (NaOCl), які змяшчае некалькі кропель Tween 20, на 10 хвілін. Нарэшце, эксплантаты тройчы прамывалі стэрыльнай дыстыляванай вадой перад пераносам у наступнае культуральнае асяроддзе.
На працягу наступных чатырох тыдняў вымяраліся параметры рэгенерацыі парасткаў, у тым ліку хуткасць рэгенерацыі, колькасць парасткаў на эксплантат і даўжыня парастка. Калі рэгенераваныя парасткі дасягалі даўжыні не менш за 2 см, іх пераносілі ў асяроддзе для ўкаранення, якое складалася з асяроддзя MS палавіннай канцэнтрацыі, 0,5 мг/л індолмасляной кіслаты (IBA) і 0,3% гуаравай смалы. Культураванне ўкаранення працягвалася на працягу трох тыдняў, на працягу якіх вымяраліся хуткасць укаранення, колькасць і даўжыня каранёў. Кожную апрацоўку паўтаралі тры разы, прычым на кожную паўторную апрацоўку культывавалі па 10 эксплантатаў, што давала прыблізна 30 эксплантатаў на адну апрацоўку.
Вышыня расліны вымяралася ў сантыметрах (см) з дапамогай лінейкі, ад асновы расліны да кончыка самага высокага ліста. Даўжыня кораня вымяралася ў міліметрах (мм) адразу пасля асцярожнага выдалення расады і выдалення субстрата для вырошчвання. Колькасць бутонаў на эксплантат падлічвалася непасрэдна на кожнай расліне. Колькасць чорных плям на лісці, вядомых як вузельчыкі, вымяралася візуальна. Лічыцца, што гэтыя чорныя вузельчыкі з'яўляюцца залозамі, якія змяшчаюць гіперыцын, або акісляльнымі плямамі, і выкарыстоўваюцца ў якасці фізіялагічнага індыкатара рэакцыі расліны на апрацоўку. Пасля выдалення ўсяго субстрата для вырошчвання свежая вага расады вымяралася з дапамогай электронных вагаў з дакладнасцю да міліграмаў (мг).
Метад разліку хуткасці ўтварэння калюса выглядае наступным чынам: пасля культывавання эксплантатаў у асяроддзі, якое змяшчае розныя рэгулятары росту (кіназы, 2,4-D і Fe3O4) на працягу чатырох тыдняў, падлічваецца колькасць эксплантатаў, здольных утвараць калюс. Формула для разліку хуткасці ўтварэння калюса наступная:
Кожную апрацоўку паўтаралі тры разы, прычым у кожным паўтарэнні даследавалі не менш за 10 эксплантатаў.
Хуткасць рэгенерацыі адлюстроўвае долю калюснай тканкі, якая паспяхова завяршае працэс дыферэнцыяцыі пупышкі пасля стадыі ўтварэння калюса. Гэты паказчык дэманструе здольнасць калюснай тканкі трансфармавацца ў дыферэнцыяваную тканку і расці ў новыя органы расліны.
Каэфіцыент укаранення — гэта суадносіны колькасці галінак, здольных да ўкаранення, да агульнай колькасці галінак. Гэты паказчык адлюстроўвае паспяховасць этапу ўкаранення, які мае вырашальнае значэнне пры мікраразмнажэнні і размнажэнні раслін, бо добрае ўкараненне дапамагае расадзе лепш выжываць ва ўмовах вырошчвання.
Гіперыцынавыя злучэнні экстрагавалі 90% метанолам. Пяцьдзясят мг высушанага расліннага матэрыялу дадалі да 1 мл метанолу і апрацоўвалі ультрагукам на працягу 20 хвілін пры 30 кГц у ультрагукавым ачышчальніку (мадэль A5120-3YJ) пры пакаёвай тэмпературы ў цемры. Пасля апрацоўкі ультрагукам узор цэнтрыфугавалі пры 6000 аб/мін на працягу 15 хвілін. Супернатант збіралі, і паглынанне гіперыцыну вымяралі пры 592 нм з дапамогай спектрафатометра Plus-3000 S у адпаведнасці з метадам, апісаным Кансейсао і інш. [14].
Большасць апрацовак рэгулятарамі росту раслін (РРР) і наначасціцамі аксіду жалеза (Fe₃O₄-НЧ) не выклікалі ўтварэння чорных клубенькаў на рэгенераваным лісці парасткаў. Ні ў адной з апрацовак з 0,5 або 1 мг/л 2,4-D, 0,5 або 1 мг/л кінеціну або 1, 2 або 4 мг/л наначасціц аксіду жалеза клубенькаў не назіралася. Некалькі камбінацый паказалі нязначнае павелічэнне развіцця клубенькаў (але не статыстычна значнае) пры больш высокіх канцэнтрацыях кінеціну і/або наначасціц аксіду жалеза, напрыклад, камбінацыя 2,4-D (0,5–2 мг/л) з кінецінам (1–1,5 мг/л) і наначасціцамі аксіду жалеза (2–4 мг/л). Гэтыя вынікі паказаны на малюнку 2. Чорныя вузельчыкі ўяўляюць сабой багатыя гіперыцынам залозы, якія сустракаюцца ў прыродзе і з'яўляюцца карыснымі. У гэтым даследаванні чорныя вузельчыкі былі ў асноўным звязаны з пацямненнем тканін, што сведчыць аб спрыяльным асяроддзі для назапашвання гіперыцыну. Апрацоўка наначасціцамі 2,4-D, кінеціну і Fe₃O₄ спрыяла росту калюса, змяншала пацямненне і павялічвала ўтрыманне хларафіла, што сведчыць аб паляпшэнні метабалічнай функцыі і патэнцыйным зніжэнні акісляльнага пашкоджання [37]. У гэтым даследаванні ацэньваўся ўплыў кінеціну ў спалучэнні з наначасціцамі 2,4-D і Fe₃O₄ на рост і развіццё калюса святаянніка (мал. 3a–g). Папярэднія даследаванні паказалі, што наначасціцы Fe₃O₄ валодаюць супрацьгрыбковай і антымікробнай актыўнасцю [38, 39] і пры выкарыстанні ў спалучэнні з рэгулятарамі росту раслін могуць стымуляваць ахоўныя механізмы раслін і зніжаць паказчыкі клеткавага стрэсу [18]. Нягледзячы на тое, што біясінтэз другасных метабалітаў рэгулюецца генетычна, іх фактычны выхад моцна залежыць ад умоў навакольнага асяроддзя. Метабалічныя і марфалагічныя змены могуць уплываць на ўзровень другасных метабалітаў, рэгулюючы экспрэсію пэўных раслінных генаў і рэагуючы на фактары навакольнага асяроддзя. Акрамя таго, індуктары могуць выклікаць актывацыю новых генаў, якія, у сваю чаргу, стымулююць ферментатыўную актыўнасць, у канчатковым выніку актывуючы некалькі біясінтэтычных шляхоў і прыводзячы да ўтварэння другасных метабалітаў. Акрамя таго, іншае даследаванне паказала, што памяншэнне зацянення павялічвае ўздзеянне сонечнага святла, тым самым павышаючы дзённую тэмпературу ў натуральным асяроддзі пражывання *Hypericum perforatum*, што таксама спрыяе павелічэнню выхаду гіперыцыну. На падставе гэтых дадзеных у гэтым даследаванні вывучалася роля наначасціц жалеза як патэнцыйных індуктараў у культуры тканін. Вынікі паказалі, што гэтыя наначасціцы могуць актываваць гены, якія ўдзельнічаюць у біясінтэзе гесперыдыну, шляхам ферментатыўнай стымуляцыі, што прыводзіць да павелічэння назапашвання гэтага злучэння (мал. 2). Такім чынам, у параўнанні з раслінамі, якія растуць у натуральных умовах, можна сцвярджаць, што вытворчасць такіх злучэнняў in vivo таксама можа быць павялічана, калі ўмераны стрэс спалучаецца з актывацыяй генаў, якія ўдзельнічаюць у біясінтэзе другасных метабалітаў. Камбінаваныя апрацоўкі, як правіла, станоўча ўплываюць на хуткасць рэгенерацыі, але ў некаторых выпадках гэты эфект аслабляецца. Прыкметна, што апрацоўка 1 мг/л 2,4-D, 1,5 мг/л кіназы і рознымі канцэнтрацыямі магла незалежна і значна павялічыць хуткасць рэгенерацыі на 50,85% у параўнанні з кантрольнай групай (мал. 4c). Гэтыя вынікі сведчаць аб тым, што пэўныя камбінацыі нанагармонаў могуць дзейнічаць сінергічна, стымулюючы рост раслін і выпрацоўку метабалітаў, што мае вялікае значэнне для культуры тканін лекавых раслін. Палмер і Келлер [50] паказалі, што апрацоўка 2,4-D можа незалежна выклікаць утварэнне калюса ў St. perforatum, у той час як даданне кіназы значна паляпшае ўтварэнне і рэгенерацыю калюса. Гэты эфект быў абумоўлены паляпшэннем гарманальнага балансу і стымуляцыяй дзялення клетак. Бал і інш. [51] выявілі, што апрацоўка Fe₃O₄-NP можа незалежна ўзмацняць функцыю антыаксідантных ферментаў, тым самым спрыяючы росту каранёў у St. perforatum. Культуральныя асяроддзі, якія змяшчаюць наначасціцы Fe₃O₄ у канцэнтрацыях 0,5 мг/л, 1 мг/л і 1,5 мг/л, палепшылі хуткасць рэгенерацыі раслін лёну [52]. Выкарыстанне кінеціну, 2,4-дыхлорбензатыязолінону і наначасціц Fe₃O₄ значна палепшыла хуткасць утварэння калюса і каранёў, аднак неабходна ўлічваць патэнцыйныя пабочныя эфекты выкарыстання гэтых гармонаў для рэгенерацыі in vitro. Напрыклад, працяглае або высокаканцэнтраванае выкарыстанне 2,4-дыхлорбензатыязалінону або кінеціну можа прывесці да саматычнай клональнай варыяцыі, акісляльнага стрэсу, анамальнай марфалогіі калюса або вітрыфікацыі. Такім чынам, высокая хуткасць рэгенерацыі не абавязкова прадказвае генетычную стабільнасць. Усе рэгенераваныя расліны павінны быць ацэнены з выкарыстаннем малекулярных маркераў (напрыклад, RAPD, ISSR, AFLP) або цытагенетычнага аналізу, каб вызначыць іх аднастайнасць і падабенства з раслінамі in vivo [53,54,55].
Гэта даследаванне ўпершыню паказала, што сумеснае выкарыстанне рэгулятараў росту раслін (2,4-D і кінеціну) з наначасціцамі Fe₃O₄ можа палепшыць морфагенез і назапашванне ключавых біялагічна актыўных метабалітаў (у тым ліку гіперыцыну і гіперазіду) у *Hypericum perforatum*. Аптымізаваны рэжым апрацоўкі (1 мг/л 2,4-D + 1 мг/л кінеціну + 4 мг/л Fe₃O₄-NP) не толькі максымізаваў утварэнне калюса, арганагенез і выхад другасных метабалітаў, але і прадэманстраваў лёгкі індуцыруючы эфект, патэнцыйна паляпшаючы стрэсаўстойлівасць расліны і яе лекавую каштоўнасць. Спалучэнне нанатэхналогій і культуры раслінных тканін забяспечвае ўстойлівую і эфектыўную платформу для маштабнай вытворчасці лекавых злучэнняў in vitro. Гэтыя вынікі адкрываюць шлях для прамысловага прымянення і будучых даследаванняў малекулярных механізмаў, аптымізацыі дазоўкі і генетычнай дакладнасці, тым самым звязваючы фундаментальныя даследаванні лекавых раслін з практычнай біятэхналогіяй.
Час публікацыі: 12 снежня 2025 г.