Рост апікальнай мерыстэмы парастка (SAM) мае вырашальнае значэнне для архітэктуры сцябла. Фізічныя гармоныгібереліны(ГА) гуляюць ключавую ролю ў каардынацыі росту раслін, але іх роля ў SAM застаецца малавывучанай. Тут мы распрацавалі ратыаметрычны біясенсар сігналізацыі ГА, змяніўшы бялок DEL, каб падавіць яго асноўную рэгуляторную функцыю ў транскрыпцыйным адказе ГА, захоўваючы пры гэтым яго дэградацыю пры распазнаванні ГА. Мы паказваем, што гэты біясенсар на аснове дэградацыі дакладна рэгіструе змены ўзроўняў ГА і клеткавага адчування падчас развіцця. Мы выкарысталі гэты біясенсар для картаграфавання актыўнасці сігналізацыі ГА ў SAM. Мы паказваем, што высокія сігналы ГА прысутнічаюць пераважна ў клетках, размешчаных паміж зачаткамі органаў, якія з'яўляюцца папярэднікамі міжвузловых клетак. Выкарыстоўваючы падыходы ўзмацнення і страты функцыі, мы дадаткова паказваем, што ГА рэгулюе арыентацыю плоскасці дзялення клетак, усталёўваючы кананічную клеткавую арганізацыю міжвузловых злучэнняў, тым самым спрыяючы спецыфікацыі міжвузловых злучэнняў у SAM.
Апікальная мерыстэма парастка (SAM), размешчаная на верхавіне парастка, утрымлівае нішу ствалавых клетак, актыўнасць якіх генеруе бакавыя органы і сцябловыя вузлы мадульным і ітэрацыйным чынам на працягу ўсяго жыцця расліны. Кожная з гэтых паўтаральных адзінак, або раслінных вузлоў, уключае міжвузлы і бакавыя органы ў вузлах, а таксама пазушныя мерыстэмы ў пазухах лісця1. Рост і арганізацыя раслінных вузлоў змяняюцца падчас развіцця. У Arabidopsis міжвузлы рост падаўляецца падчас вегетатыўнай стадыі, і пазушныя мерыстэмы застаюцца ў стане спакою ў пазухах лісця разеткі. Падчас пераходу да фазы кветання SAM становіцца мерыстэмай суквецця, генеруючы падоўжаныя міжвузлы і пазушныя пупышкі, галінкі ў пазухах сцеблавых лісця, а пазней - бязлісцевыя кветкі2. Нягледзячы на значны прагрэс у разуменні механізмаў, якія кантралююць зараджэнне лісця, кветак і галін, адносна мала вядома пра тое, як узнікаюць міжвузлы.
Разуменне прасторава-часавага размеркавання ГА дапаможа лепш зразумець функцыі гэтых гармонаў у розных тканінах і на розных стадыях развіцця. Візуалізацыя дэградацыі зліцця RGA-GFP, экспрэсаванага пад дзеяннем уласнага прамотара, дае важную інфармацыю аб рэгуляцыі агульнага ўзроўню ГА ў каранях15,16. Аднак экспрэсія RGA вар'іруецца ў розных тканінах17 і рэгулюецца ГА18. Такім чынам, дыферэнцыяльная экспрэсія прамотара RGA можа прывесці да флуарэсцэнтнай карціны, якая назіраецца пры RGA-GFP, і таму гэты метад не з'яўляецца колькасным. Зусім нядаўна біяактыўная флуарэсцэінам (Fl) мечаная ГА19,20 выявіла назапашванне ГА ў эндакортэксе кораня і рэгуляцыю яе клеткавых узроўняў шляхам транспарту ГА. Нядаўна датчык GA FRET nlsGPS1 паказаў, што ўзроўні ГА карэлююць з падаўжэннем клетак у каранях, нітках і цёмнарослых гіпакатылях21. Аднак, як мы бачылі, канцэнтрацыя ГА не з'яўляецца адзіным параметрам, які кантралюе сігнальную актыўнасць ГА, паколькі яна залежыць ад складаных працэсаў адчування. Тут, абапіраючыся на наша разуменне сігнальных шляхоўella і GA, мы паведамляем аб распрацоўцы і характарыстыцы ратыаметрычнага біясенсара на аснове дэградацыі для сігналізацыі GA. Для распрацоўкі гэтага колькаснага біясенсара мы выкарысталі мутантны GA-адчувальны RGA, які быў зліты з флуарэсцэнтным бялком і паўсюдна экспрэсаваны ў тканінах, а таксама GA-неадчувальны флуарэсцэнтны бялок. Мы паказваем, што зліцці мутантных RGA-бялкоў не перашкаджаюць эндагеннай сігналізацыі GA пры паўсюднай экспрэсіі, і што гэты біясенсар можа колькасна ацаніць сігнальную актыўнасць, якая ўзнікае як у выніку ўваходнага сігналу GA, так і апрацоўкі сігналу GA сэнсарным апаратам, з высокім прасторава-часавым дазволам. Мы выкарысталі гэты біясенсар для картаграфавання прасторава-часавага размеркавання сігнальнай актыўнасці GA і колькасна ацэньвання таго, як GA рэгулюе паводзіны клетак у эпідэрмісе SAM. Мы паказваем, што GA рэгулюе арыентацыю плоскасці дзялення клетак SAM, размешчаных паміж зачаткамі органаў, тым самым вызначаючы кананічную клеткавую арганізацыю міжвузла.
Нарэшце, мы спыталі, ці можа qmRGA паведамляць пра змены ўзроўню эндагеннай GA з выкарыстаннем растучых гіпакатыляў. Раней мы паказалі, што нітраты стымулююць рост, павялічваючы сінтэз GA і, у сваю чаргу, дэградацыю PENNSYLVAN 34. Адпаведна, мы назіралі, што даўжыня гіпакатыля ў расадзе pUBQ10::qmRGA, вырашчанай пры багатым паступленні нітратаў (10 мМ NO3−), была значна большай, чым у расадзе, вырашчанай ва ўмовах дэфіцыту нітратаў (Дадатковы малюнак 6a). У адпаведнасці з рэакцыяй росту, сігналы GA былі вышэй у гіпакатылях расады, вырашчанай пры ўмовах 10 мМ NO3−, чым у расадзе, вырашчанай без нітратаў (Дадатковы малюнак 6b, c). Такім чынам, qmRGA таксама дазваляе маніторынгаваць змены ў сігналізацыі GA, выкліканыя эндагеннымі зменамі канцэнтрацыі GA.
Каб зразумець, ці залежыць сігнальная актыўнасць GA, якая выяўляецца з дапамогай qmRGA, ад канцэнтрацыі GA і ўспрымання GA, як і чакалася зыходзячы з канструкцыі датчыка, мы прааналізавалі экспрэсію трох рэцэптараў GID1 у вегетатыўных і рэпрадуктыўных тканінах. У расадзе рэпарцёрная лінія GID1-GUS паказала, што GID1a і c былі высока экспрэсаваны ў семядолях (мал. 3a–c). Акрамя таго, усе тры рэцэптары экспрэсаваліся ў лісці, бакавых зачатках каранёў, кончыках каранёў (акрамя коранявога каўпачка GID1b) і сасудзістай сістэме (мал. 3a–c). У суквецці SAM мы выявілі сігналы GUS толькі для GID1b і 1c (дадатковы мал. 7a–c). Гібрыдызацыя in situ пацвердзіла гэтыя заканамернасці экспрэсіі і дадаткова прадэманстравала, што GID1c раўнамерна экспрэсаваўся на нізкіх узроўнях у SAM, тады як GID1b прадэманстраваў больш высокую экспрэсію на перыферыі SAM (дадатковы мал. 7d–l). Трансляцыйнае зліццё pGID1b::2xmTQ2-GID1b таксама выявіла градуяваны дыяпазон экспрэсіі GID1b, ад нізкай або адсутнасці экспрэсіі ў цэнтры SAM да высокай экспрэсіі на межах органаў (Дадатковы мал. 7m). Такім чынам, рэцэптары GID1 нераўнамерна размеркаваны па тканінах і ўнутры іх. У наступных эксперыментах мы таксама назіралі, што празмерная экспрэсія GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) павялічвала адчувальнасць qmRGA ў гіпакатылях да знешняга прымянення GA (мал. 3d, e). Наадварот, флуарэсцэнцыя, вымераная з дапамогай qd17mRGA ў гіпакатылі, была неадчувальнай да апрацоўкі GA3 (мал. 3f, g). У абодвух аналізах расаду апрацоўвалі высокімі канцэнтрацыямі GA (100 мкМ GA3) для ацэнкі хуткай паводзін датчыка, дзе здольнасць звязвацца з рэцэптарам GID1 павялічвалася або гублялася. Разам гэтыя вынікі пацвярджаюць, што біясенсар qmRGA выконвае камбінаваную функцыю як сенсара GA і GA, і сведчаць аб тым, што дыферэнцыяльная экспрэсія рэцэптара GID1 можа значна мадуляваць эмісійную здольнасць сенсара.
Да цяперашняга часу размеркаванне сігналаў GA ў SAM застаецца незразумелым. Таму мы выкарысталі расліны, якія экспрэсуюць qmRGA, і рэпарцёр ствалавых клетак pCLV3::mCherry-NLS35 для разліку колькасных карт сігнальнай актыўнасці GA з высокім разрозненнем, засяродзіўшы ўвагу на пласце L1 (эпідэрміс; мал. 4a, b, гл. Метады і дадатковыя метады), паколькі L1 гуляе ключавую ролю ў кантролі росту SAM36. Тут экспрэсія pCLV3::mCherry-NLS забяспечыла фіксаваную геаметрычную кропку адліку для аналізу прасторава-часавага размеркавання сігнальнай актыўнасці GA37. Нягледзячы на тое, што GA лічыцца неабходным для развіцця бакавых органаў4, мы назіралі, што сігналы GA былі нізкімі ў кветкавым зародку (P), пачынаючы са стадыі P3 (мал. 4a, b), тады як маладыя зародкі P1 і P2 мелі ўмераную актыўнасць, падобную да актыўнасці ў цэнтральнай вобласці (мал. 4a, b). Больш высокая сігнальная актыўнасць GA была выяўлена на межах зачаткаў органаў, пачынаючы з P1/P2 (па баках мяжы) і дасягаючы піку на P4, а таксама ва ўсіх клетках перыферычнай вобласці, размешчанай паміж зачаткамі (мал. 4a, b і дадатковы мал. 8a, b). Гэтая больш высокая сігнальная актыўнасць GA назіралася не толькі ў эпідэрмісе, але і ў пластах L2 і верхнім L3 (дадатковы мал. 8b). Карціна сігналаў GA, выяўленых у SAM з выкарыстаннем qmRGA, таксама заставалася нязменнай з цягам часу (дадатковы мал. 8c–f, k). Нягледзячы на тое, што канструкцыя qd17mRGA сістэматычна зніжалася ў SAM раслін T3 з пяці незалежных ліній, якія мы падрабязна ахарактарызавалі, мы змаглі прааналізаваць карціны флуарэсцэнцыі, атрыманыя з дапамогай канструкцыі pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (дадатковы мал. 8g–j, l). У гэтай кантрольнай лініі былі выяўлены толькі нязначныя змены ў каэфіцыенце флуарэсцэнцыі ў SAM, але ў цэнтры SAM мы назіралі відавочнае і нечаканае зніжэнне VENUS, звязанае з TagBFP. Гэта пацвярджае, што сігнальны патэрн, які назіраецца qmRGA, адлюстроўвае GA-залежную дэградацыю mRGA-VENUS, але таксама дэманструе, што qmRGA можа пераацэньваць сігнальную актыўнасць GA ў цэнтры мерыстэмы. Увогуле, нашы вынікі паказваюць сігнальны патэрн GA, які ў першую чаргу адлюстроўвае размеркаванне зародкаў. Гэта размеркаванне міжзародкавай вобласці (IPR) абумоўлена паступовым усталяваннем высокай сігнальнай актыўнасці GA паміж развіваючымся зародкам і цэнтральнай вобласцю, у той жа час сігнальная актыўнасць GA ў зародку зніжаецца (мал. 4c, d).
Размеркаванне рэцэптараў GID1b і GID1c (гл. вышэй) сведчыць аб тым, што дыферэнцыяльная экспрэсія рэцэптараў GA дапамагае фармаваць характар сігнальнай актыўнасці GA ў SAM. Мы задаваліся пытаннем, ці можа быць звязана дыферэнцыяльнае назапашванне GA. Каб даследаваць гэтую магчымасць, мы выкарысталі датчык nlsGPS1 GA FRET21. Павышаная частата актывацыі была выяўлена ў SAM nlsGPS1, апрацаванага 10 мкМ GA4+7 на працягу 100 хвілін (Дадатковы мал. 9a-e), што сведчыць аб тым, што nlsGPS1 рэагуе на змены канцэнтрацыі GA ў SAM, як і ў каранях21. Прасторавае размеркаванне частаты актывацыі nlsGPS1 выявіла адносна нізкія ўзроўні GA ў вонкавых пластах SAM, але паказала, што яны былі павышаны ў цэнтры і на межах SAM (Мал. 4e і Дадатковы мал. 9a,c). Гэта сведчыць аб тым, што GA таксама размеркавана ў SAM з прасторавай карцінай, параўнальнай з той, што выяўлена з дапамогай qmRGA. У якасці дадатковага падыходу мы таксама апрацавалі SAM флуарэсцэнтным GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) або толькі Fl у якасці адмоўнага кантролю. Сігнал Fl быў размеркаваны па ўсім SAM, уключаючы цэнтральную вобласць і зародак, хоць і з меншай інтэнсіўнасцю (мал. 4j і дадатковы мал. 10d). Наадварот, усе тры GA-Fl назапашваліся спецыфічна ў межах зародка і ў рознай ступені ў астатняй частцы IPR, прычым GA7-Fl назапашваўся ў найбольшым дамене ў IPR (мал. 4k і дадатковы мал. 10a,b). Колькасная ацэнка інтэнсіўнасці флуарэсцэнцыі паказала, што суадносіны інтэнсіўнасці IPR да не-IPR было вышэй у SAM, апрацаваным GA-Fl, у параўнанні з SAM, апрацаваным Fl (мал. 4l і дадатковы мал. 10c). Разам гэтыя вынікі сведчаць аб тым, што GA прысутнічае ў больш высокіх канцэнтрацыях у клетках IPR, якія размешчаны бліжэй за ўсё да мяжы органа. Гэта сведчыць аб тым, што характар сігнальнай актыўнасці SAM GA з'яўляецца вынікам як дыферэнцыяльнай экспрэсіі рэцэптараў GA, так і дыферэнцыяльнага назапашвання GA ў клетках IPR паблізу межаў органа. Такім чынам, наш аналіз выявіў нечаканы прасторава-часавы патэрн сігналізацыі GA, з больш нізкай актыўнасцю ў цэнтры і зачатку SAM і больш высокай актыўнасцю ў IPR у перыферычнай вобласці.
Каб зразумець ролю дыферэнцыяльнай сігнальнай актыўнасці GA ў SAM, мы прааналізавалі карэляцыю паміж сігнальнай актыўнасцю GA, пашырэннем клетак і дзяленнем клетак з выкарыстаннем візуалізацыі SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS у рэжыме рэальнага часу. Улічваючы ролю GA ў рэгуляцыі росту, чакалася станоўчая карэляцыя з параметрамі пашырэння клетак. Таму мы спачатку параўналі карты сігнальнай актыўнасці GA з картамі хуткасці росту паверхні клетак (як паказчык сілы пашырэння клетак для дадзенай клеткі і для даччыных клетак пры дзяленні) і з картамі анізатрапіі росту, якая вымярае накіраванасць пашырэння клетак (таксама выкарыстоўваецца тут для дадзенай клеткі і для даччыных клетак пры дзяленні; Мал. 5a,b, гл. Метады і дадатковыя метады). Нашы карты хуткасці росту паверхні клетак SAM адпавядаюць папярэднім назіранням38,39, з мінімальнымі хуткасцямі росту на мяжы і максімальнымі хуткасцямі росту ў кветках, якія развіваюцца (Мал. 5a). Аналіз галоўных кампанент (PCA) паказаў, што сігнальная актыўнасць GA адмоўна карэлюе з інтэнсіўнасцю росту паверхні клетак (Мал. 5c). Мы таксама паказалі, што асноўныя восі варыяцыі, у тым ліку ўваходны сігнал GA і інтэнсіўнасць росту, былі артаганальнымі да кірунку, вызначанага высокай экспрэсіяй CLV3, што пацвярджае выключэнне клетак з цэнтра SAM у астатніх аналізах. Карэляцыйны аналіз Спірмена пацвердзіў вынікі PCA (малюнак 5d), паказваючы, што больш высокія сігналы GA ў IPR не прывялі да большага пашырэння клетак. Аднак карэляцыйны аналіз выявіў невялікую станоўчую карэляцыю паміж актыўнасцю сігналізацыі GA і анізатрапіяй росту (малюнак 5c, d), што сведчыць аб тым, што больш высокі сігнал GA ў IPR уплывае на кірунак росту клетак і, магчыма, на становішча плоскасці дзялення клетак.
a, b Цеплавыя карты сярэдняга росту паверхні (a) і анізатрапіі росту (b) у SAM, усредненыя па сямі незалежных раслінах (выкарыстоўваліся ў якасці паказчыкаў сілы і кірунку пашырэння клетак адпаведна). c PCA-аналіз уключаў наступныя зменныя: сігнал GA, інтэнсіўнасць росту паверхні, анізатрапія росту паверхні і экспрэсія CLV3. Кампанент PCA 1 у асноўным адмоўна карэляваў з інтэнсіўнасцю росту паверхні і станоўча карэляваў з сігналам GA. Кампанент PCA 2 у асноўным станоўча карэляваў з анізатрапіяй росту паверхні і адмоўна карэляваў з экспрэсіяй CLV3. Працэнты прадстаўляюць варыяцыю, тлумачаную кожным кампанентам. d Карэляцыйны аналіз Спірмена паміж сігналам GA, інтэнсіўнасцю росту паверхні і анізатрапіяй росту паверхні ў маштабе тканіны, за выключэннем CZ. Лічба справа - гэта значэнне rho Спірмена паміж двума зменнымі. Зорачкі паказваюць выпадкі, калі карэляцыя/адмоўная карэляцыя вельмі значная. e 3D-візуалізацыя клетак Col-0 SAM L1 з дапамогай канфакальнай мікраскапіі. Новыя клеткавыя сценкі, якія ўтварыліся ў SAM (але не ў зародку) праз 10 гадзін, афарбаваны ў адпаведнасці з іх значэннямі вуглоў. Каляровая паласа паказана ў правым ніжнім куце. Устаўка паказвае адпаведнае 3D-выяву ў 0 гадзін. Эксперымент быў паўтораны двойчы з падобнымі вынікамі. f Рамкавыя дыяграмы паказваюць хуткасць дзялення клетак у IPR і не-IPR Col-0 SAM (n = 10 незалежных раслін). Цэнтральная лінія паказвае медыяну, а межы рамкі паказваюць 25-ы і 75-ы перцэнтылі. Вусы паказваюць мінімальныя і максімальныя значэнні, вызначаныя з дапамогай праграмнага забеспячэння R. Значэнні P былі атрыманы з дапамогай двухбаковага t-крытэрыя Уэлча. g, h Схематычная дыяграма, якая паказвае (g), як вымераць вугал новай клеткавай сценкі (пурпурны) адносна радыяльнага кірунку ад цэнтра SAM (белая пунцірная лінія) (улічваюцца толькі значэнні вострых вуглоў, г.зн. 0–90°), і (h) акружныя/бакавыя і радыяльныя напрамкі ўнутры мерыстэмы. i Частотныя гістаграмы арыентацыі плоскасці дзялення клетак па SAM (цёмна-сіні), IPR (сярэдне-сіні) і не-IPR (светла-сіні) адпаведна. Значэнні P былі атрыманы з дапамогай двухбаковага тэсту Калмагорава-Смірнова. Эксперымент быў паўтораны двойчы з падобнымі вынікамі. j Частотныя гістаграмы арыентацыі плоскасці дзялення клетак IPR вакол P3 (светла-зялёны), P4 (сярэдне-зялёны) і P5 (цёмна-зялёны) адпаведна. Значэнні P былі атрыманы з дапамогай двухбаковага тэсту Калмагорава-Смірнова. Эксперымент быў паўтораны двойчы з падобнымі вынікамі.
Такім чынам, далей мы даследавалі карэляцыю паміж сігналізацыяй GA і актыўнасцю дзялення клетак, ідэнтыфікуючы нядаўна ўтвораныя клеткавыя сценкі падчас аналізу (мал. 5e). Гэты падыход дазволіў нам вымераць частату і кірунак дзялення клетак. Дзіўна, але мы выявілі, што частата дзяленняў клетак у IPR і астатняй частцы SAM (не-IPR, мал. 5f) была падобнай, што сведчыць аб тым, што адрозненні ў сігналізацыі GA паміж клеткамі IPR і не-IPR не ўплываюць істотна на дзяленне клетак. Гэта, а таксама станоўчая карэляцыя паміж сігналізацыяй GA і анізатрапіяй росту, падштурхнулі нас да разгляду пытання аб тым, ці можа актыўнасць сігналізацыі GA ўплываць на арыентацыю плоскасці дзялення клетак. Мы вымералі арыентацыю новай клеткавай сценкі як востры вугал адносна радыяльнай восі, якая злучае цэнтр мерыстэмы і цэнтр новай клеткавай сценкі (мал. 5e-i), і назіралі выразную тэндэнцыю да дзялення клетак пад вугламі, блізкімі да 90° адносна радыяльнай восі, з найвышэйшымі частотамі, назіранымі пры 70–80° (23,28%) і 80–90° (22,62%) (мал. 5e,i), што адпавядае дзяленню клетак у акружным/папярочным кірунку (мал. 5h). Каб вывучыць уклад сігналізацыі GA ў гэтую паводзіны дзялення клетак, мы прааналізавалі параметры дзялення клетак у IPR і не-IPR асобна (мал. 5i). Мы назіралі, што размеркаванне вуглоў дзялення ў клетках IPR адрознівалася ад размеркавання ў клетках без IPR або ў клетках ва ўсім SAM, прычым клеткі IPR дэманстравалі большую долю латэральных/цыркулярных дзяленняў клетак, г.зн. 70–80° і 80–90° (33,86% і 30,71% адпаведна, адпаведныя прапорцыі) (мал. 5i). Такім чынам, нашы назіранні выявілі сувязь паміж высокай сігналізацыяй GA і арыентацыяй плоскасці дзялення клетак, блізкай да акружнага кірунку, падобную карэляцыі паміж актыўнасцю сігналізацыі GA і анізатрапіяй росту (мал. 5c, d). Каб далей усталяваць прасторавую захаванасць гэтай сувязі, мы вымералі арыентацыю плоскасці дзялення ў клетках IPR, якія атачаюць зачатак, пачынаючы з P3, паколькі найвышэйшая актыўнасць сігналізацыі GA была выяўлена ў гэтай вобласці, пачынаючы з P4 (мал. 4). Вуглы дзялення IPR вакол P3 і P4 не паказалі статыстычна значных адрозненняў, хоць у IPR вакол P4 назіралася павелічэнне частата латэральных дзяленняў клетак (мал. 5j). Аднак у клетках IPR каля P5 розніца ў арыентацыі плоскасці дзялення клетак стала статыстычна значнай, з рэзкім павелічэннем частаты папярочных дзяленняў клетак (мал. 5j). Разам гэтыя вынікі сведчаць аб тым, што сігналізацыя GA можа кантраляваць арыентацыю дзяленняў клетак у SAM, што адпавядае папярэднім паведамленням40,41 аб тым, што высокая сігналізацыя GA можа выклікаць латэральную арыентацыю дзяленняў клетак у IPR.
Прагназуецца, што клеткі ў IPR не будуць уключаны ў зачаткі, а хутчэй у міжвузеллі2,42,43. Папярочная арыентацыя клеткавых дзяленняў у IPR можа прывесці да тыповай арганізацыі паралельных падоўжных радоў эпідэрмальных клетак у міжвузеллі. Нашы назіранні, апісаныя вышэй, сведчаць аб тым, што сігналізацыя GA, верагодна, адыгрывае ролю ў гэтым працэсе, рэгулюючы кірунак клеткавага дзялення.
Страта функцыі некалькіх генаў DEL прыводзіць да канстытутыўнага GA-адказу, і для праверкі гэтай гіпотэзы можна выкарыстоўваць мутанты della44. Спачатку мы прааналізавалі характар экспрэсіі пяці генаў DEL у SAM. Транскрыпцыйнае зліццё лініі GUS45 паказала, што GAI, RGA, RGL1 і RGL2 (у значна меншай ступені) экспрэсаваліся ў SAM (Дадатковы мал. 11a–d). Гібрыдызацыя in situ дадаткова паказала, што мРНК GAI назапашваецца спецыфічна ў зародках і кветках, якія развіваюцца (Дадатковы мал. 11e). мРНК RGL1 і RGL3 былі выяўлены па ўсім полагу SAM і ў старых кветках, тады як мРНК RGL2 была больш распаўсюджана ў памежнай вобласці (Дадатковы мал. 11f–h). Канфакальная візуалізацыя pRGL3::RGL3-GFP SAM пацвердзіла экспрэсію, якая назіралася пры гібрыдызацыі in situ, і паказала, што бялок RGL3 назапашваецца ў цэнтральнай частцы SAM (Дадатковы мал. 11i). Выкарыстоўваючы лінію pRGA::GFP-RGA, мы таксама выявілі, што бялок RGA назапашваецца ў SAM, але яго колькасць памяншаецца на мяжы, пачынаючы з P4 (дадатковы мал. 11j). Прыкметна, што характар экспрэсіі RGL3 і RGA адпавядаюць больш высокай сігнальнай актыўнасці GA ў IPR, што было выяўлена з дапамогай qmRGA (мал. 4). Больш за тое, гэтыя дадзеныя паказваюць, што ўсе ДЭЛА экспрэсуюцца ў SAM і што іх экспрэсія сумесна ахоплівае ўвесь SAM.
Далей мы прааналізавалі параметры дзялення клетак у SAM дзікага тыпу (Ler, кантроль) і мутантаў gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (глабальных) (мал. 6a, b). Цікава, што мы назіралі статыстычна значны зрух у размеркаванні частот вуглоў дзялення клетак у SAM мутанта della global у параўнанні з дзікім тыпам (мал. 6c). Гэта змяненне ў мутанта della global было абумоўлена павелічэннем частаты вуглоў 80–90° (34,71% супраць 24,55%) і, у меншай ступені, вуглоў 70–80° (23,78% супраць 20,18%), г.зн. адпавядае папярочным дзяленням клетак (мал. 6c). Частата непапярочных дзяленняў (0–60°) таксама была ніжэйшай у мутанта della global (мал. 6c). Частата папярочных дзяленняў клетак была значна павялічана ў SAM мутанта della global (мал. 6b). Частата папярочных дзяленняў клетак у IPR таксама была вышэйшай у мутанта della global у параўнанні з дзікім тыпам (мал. 6d). Па-за вобласцю IPR дзікі тып меў больш раўнамернае размеркаванне вуглоў дзялення клетак, у той час як мутант della global аддаваў перавагу тангенцыяльным дзяленням, падобным да IPR (мал. 6e). Мы таксама колькасна вызначылі арыентацыю дзяленняў клетак у SAM пяціразовых мутантаў ga2-аксідазы (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 і ga2ox6-2), GA-неактыўнага мутанта, у якім назапашваецца GA. У адпаведнасці з павелічэннем узроўняў GA, SAM пяцічастковага мутантнага суквецці ga2ox быў большым, чым у Col-0 (дадатковы мал. 12a, b), і ў параўнанні з Col-0, пяцічастковы ga2ox SAM прадэманстраваў выразна адрознае размеркаванне вуглоў дзялення клетак, прычым частата вуглоў павялічвалася ад 50° да 90°, г.зн. зноў жа на карысць тангенцыяльных дзяленняў (дадатковы мал. 12a–c). Такім чынам, мы паказваем, што канстытутыўная актывацыя сігналізацыі GA і назапашванне GA выклікаюць бакавыя дзяленні клетак у IPR і астатняй частцы SAM.
a, b 3D-візуалізацыя L1-слоя SAM, афарбаванага PI, Ler (a) і глабальнага мутанта della (b) з выкарыстаннем канфакальнай мікраскапіі. Новыя клеткавыя сценкі, якія ўтварыліся ў SAM (але не ў зародку) на працягу 10-гадзіннага перыяду, паказаны і афарбаваны ў адпаведнасці з іх значэннямі вуглоў. Устаўка паказвае SAM у 0 гадзін. Каляровая паласа адлюстроўваецца ў правым ніжнім куце. Стрэлка ў (b) паказвае на прыклад выраўнаваных файлаў клетак у глабальным мутанце della. Эксперымент быў паўтораны двойчы з падобнымі вынікамі. ce параўнанне размеркавання частаты арыентацый плоскасцяў дзялення клетак ва ўсім SAM (d), IPR (e) і не-IPR (f) паміж Ler і глабальнай della. Значэнні P былі атрыманы з выкарыстаннем двухбаковага тэсту Колмагорава-Смірнова. f, g 3D-візуалізацыя канфакальных выяў SAM, афарбаванага PI, трансгенных раслін Col-0 (i) і pCUC2::gai-1-VENUS (j). На панэлях (a, b) паказаны новыя клеткавыя сценкі (але не зачаткі), якія ўтварыліся ў SAM на працягу 10 гадзін. Эксперымент паўтарылі двойчы з падобнымі вынікамі. h–j Параўнанне размеркавання частаты арыентацый плоскасцяў дзялення клетак, размешчаных ва ўсім SAM (h), IPR (i) і не-IPR (j) паміж раслінамі Col-0 і pCUC2::gai-1-VENUS. Значэнні P былі атрыманы з дапамогай двухбаковага тэсту Колмагорава-Смірнова.
Далей мы пратэставалі эфект інгібіравання сігналізацыі GA спецыяльна ў IPR. Для гэтага мы выкарысталі прамотар кубачка семядолі 2 (CUC2) для стымулявання экспрэсіі дамінантна-негатыўнага бялку gai-1, злітага з VENUS (у лініі pCUC2::gai-1-VENUS). У SAM дзікага тыпу прамотар CUC2 кіруе экспрэсіяй большасці IPR у SAM, уключаючы памежныя клеткі, пачынаючы з P4, і падобная спецыфічная экспрэсія назіралася ў раслін pCUC2::gai-1-VENUS (гл. ніжэй). Размеркаванне вуглоў дзялення клетак па SAM або IPR раслін pCUC2::gai-1-VENUS істотна не адрознівалася ад размеркавання вуглоў дзялення клетак дзікага тыпу, хоць нечакана мы выявілі, што клеткі без IPR у гэтых раслінах дзяліліся з больш высокай частатой 80–90° (мал. 6f–j).
Было выказана меркаванне, што кірунак дзялення клетак залежыць ад геаметрыі SAM, у прыватнасці, ад напружання расцяжэння, якое ўзнікае з-за крывізны тканіны46. Таму мы задаліся пытаннем, ці змянілася форма SAM у мутантаў della global і раслін pCUC2::gai-1-VENUS. Як паведамлялася раней12, памер SAM мутанта della global быў большым, чым у дзікага тыпу (дадатковы малюнак 13a, b, d). Гібрыдызацыя in situ РНК CLV3 і STM пацвердзіла пашырэнне мерыстэмы ў мутантаў della і дадаткова паказала латэральнае пашырэнне нішы ствалавых клетак (дадатковы малюнак 13e, f, h, i). Аднак крывізна SAM была падобнай у абодвух генатыпах (дадатковы малюнак 13k, m, n, p). Мы назіралі падобнае павелічэнне памеру ў чатырохкратнага мутанта gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della без змены крывізны ў параўнанні з дзікім тыпам (дадатковы малюнак 13c, d, g, j, l, o, p). Частата арыентацыі дзяленняў клетак таксама змянілася ў чатырохкратнага мутанта della, але ў меншай ступені, чым у маналітнага мутанта della (дадатковы мал. 12d–f). Гэты эфект дазоўкі, разам з адсутнасцю ўплыву на крывізну, сведчыць аб тым, што рэшткавая актыўнасць RGL3 у чатырохкратным мутанце Della абмяжоўвае змены ў арыентацыі дзяленняў клетак, выкліканыя стратай актыўнасці DELLA, і што змены ў бакавых дзяленнях клетак адбываюцца ў адказ на змены ў сігнальнай актыўнасці GA, а не на змены ў геаметрыі SAM. Як апісана вышэй, прамотар CUC2 кіруе экспрэсіяй IPR у SAM, пачынаючы з P4 (дадатковы мал. 14a, b), і, наадварот, pCUC2::gai-1-VENUS SAM меў паменшаны памер, але большую крывізну (дадатковы мал. 14c–h). Гэта змяненне марфалогіі pCUC2::gai-1-VENUS SAM можа прывесці да іншага размеркавання механічных напружанняў у параўнанні з дзікім тыпам, у якім высокія акружныя напружанні пачынаюцца на меншай адлегласці ад цэнтра SAM47. Акрамя таго, змены ў марфалогіі pCUC2::gai-1-VENUS SAM могуць быць вынікам змен рэгіянальных механічных уласцівасцей, выкліканых экспрэсіяй трансгена48. У абодвух выпадках гэта можа часткова кампенсаваць наступствы змяненняў сігналізацыі GA, павялічваючы верагоднасць таго, што клеткі будуць дзяліцца ў акружнай/папярочнай арыентацыі, што тлумачыць нашы назіранні.
Узятыя разам, нашы дадзеныя пацвярджаюць, што вышэйшая сігналізацыя GA адыгрывае актыўную ролю ў латэральнай арыентацыі плоскасці дзялення клетак у IPR. Яны таксама паказваюць, што крывізна мерыстэмы таксама ўплывае на арыентацыю плоскасці дзялення клетак у IPR.
Папярочная арыентацыя плоскасці дзялення ў IPR, з-за высокай актыўнасці сігналізацыі GA, сведчыць аб тым, што GA папярэдне арганізуе радыяльны клетачны файл у эпідэрмісе ўнутры SAM, каб вызначыць клетачную арганізацыю, якая пазней будзе знойдзена ў эпідэрмальным міжвузлі. Сапраўды, такія клетачныя файлы часта былі бачныя на SAM-выявах мутантаў della global (мал. 6b). Такім чынам, каб далей даследаваць развіццёвую функцыю прасторавага патэрну сігналізацыі GA ў SAM, мы выкарысталі пакадравую візуалізацыю для аналізу прасторавай арганізацыі клетак у IPR у раслін дзікага тыпу (Ler і Col-0), мутантаў della global і трансгенных раслін pCUC2::gai-1-VENUS.
Мы выявілі, што qmRGA паказаў, што актыўнасць сігналізацыі GA ў IPR павялічвалася з P1/P2 і дасягала піку на P4, і гэтая заканамернасць заставалася нязменнай з цягам часу (мал. 4a–f і дадатковы мал. 8c–f, k). Каб прааналізаваць прасторавую арганізацыю клетак у IPR з павелічэннем сігналу GA, мы пазначылі клеткі Ler IPR вышэй і па баках ад P4 у адпаведнасці з іх развіццёвым лёсам, прааналізаваным праз 34 гадзіны пасля першага назірання, г.зн. больш чым праз два пластыдныя часы, што дазволіла нам сачыць за клеткамі IPR падчас развіцця зачатка ад P1/P2 да P4. Мы выкарыстоўвалі тры розныя колеры: жоўты для тых клетак, якія былі інтэграваны ў зачатак каля P4, зялёны для тых, якія знаходзіліся ў IPR, і фіялетавы для тых, якія ўдзельнічалі ў абодвух працэсах (мал. 7a–c). Пры t0 (0 гадзін) 1–2 пласты клетак IPR былі бачныя перад P4 (мал. 7a). Як і чакалася, калі гэтыя клеткі дзяліліся, яны рабілі гэта ў асноўным праз папярочную плоскасць дзялення (мал. 7a–c). Падобныя вынікі былі атрыманы з выкарыстаннем Col-0 SAM (з акцэнтам на P3, мяжа якога складваецца падобна да P4 у Ler), хоць у гэтым генатыпе зморшчына, якая ўтварылася на кветкавай мяжы, хутчэй хавала клеткі IPR (мал. 7g–i). Такім чынам, схема дзялення клетак IPR загадзя арганізуе клеткі ў радыяльныя шэрагі, як у міжвузеллях. Арганізацыя радыяльных шэрагаў і лакалізацыя клетак IPR паміж паслядоўнымі органамі сведчаць аб тым, што гэтыя клеткі з'яўляюцца міжвузловымі клеткамі-папярэднікамі.
Тут мы распрацавалі ратыаметрычны біясенсар сігналізацыі ГА, qmRGA, які дазваляе колькасна картаграфаваць сігнальную актыўнасць ГА, якая ўзнікае ў выніку камбінаваных канцэнтрацый ГА і рэцэптараў ГА, мінімізуючы пры гэтым перашкоды эндагенным сігнальным шляхам, тым самым забяспечваючы інфармацыю аб функцыі ГА на клеткавым узроўні. З гэтай мэтай мы сканструявалі мадыфікаваны бялок ДЭЛА, mRGA, які страціў здольнасць звязвацца з партнёрамі па ўзаемадзеянні ДЭЛА, але застаецца адчувальным да пратэалізу, выкліканага ГА. qmRGA рэагуе як на экзагенныя, так і на эндагенныя змены ўзроўняў ГА, а яго дынамічныя сэнсарныя ўласцівасці дазваляюць ацэньваць прасторава-часавыя змены сігнальнай актыўнасці ГА падчас развіцця. qmRGA таксама з'яўляецца вельмі гнуткім інструментам, паколькі яго можна адаптаваць да розных тканін шляхам змены прамотара, які выкарыстоўваецца для яго экспрэсіі (пры неабходнасці), і, улічваючы кансерватыўны характар сігнальнага шляху ГА і матыву PFYRE ў пакрытанасенных раслін, ён, верагодна, можа быць перанесены на іншыя віды22. У адпаведнасці з гэтым, эквівалентная мутацыя ў рысавым бялку SLR1 (HYY497AAA) таксама паказала, што падаўляе рэпрэсарную актыўнасць росту SLR1, толькі нязначна зніжаючы яго дэградацыю, апасродкаваную GA, падобна mRGA23. Прыкметна, што нядаўнія даследаванні на Arabidopsis паказалі, што мутацыя адной амінакіслоты ў дамене PFYRE (S474L) змяніла транскрыпцыйную актыўнасць RGA, не ўплываючы на яго здольнасць узаемадзейнічаць з партнёрамі транскрыпцыйных фактараў50. Нягледзячы на тое, што гэтая мутацыя вельмі блізкая да 3 замен амінакіслот, прысутных у mRGA, нашы даследаванні паказваюць, што гэтыя дзве мутацыі змяняюць розныя характарыстыкі Нягледзячы на тое, што большасць партнёраў транскрыпцыйных фактараў звязваюцца з даменамі LHR1 і SAW26,51, некаторыя кансерватыўныя амінакіслоты ў дамене PFYRE могуць дапамагчы стабілізаваць гэтыя ўзаемадзеянні.
Развіццё міжвузлоў з'яўляецца ключавой рысай у архітэктуры раслін і паляпшэнні ўраджайнасці. qmRGA выявіў больш высокую актыўнасць сігналізацыі GA ў клетках-папярэдніках міжвузлоў IPR. Спалучаючы колькасную візуалізацыю і генетыку, мы паказалі, што сігнальныя патэрны GA накладваюць кругавыя/папярочныя плоскасці дзялення клетак у эпідэрмісе SAM, фарміруючы арганізацыю дзялення клетак, неабходную для развіцця міжвузлоў. Падчас развіцця было выяўлена некалькі рэгулятараў арыентацыі плоскасці дзялення клетак52,53. Наша праца дае выразны прыклад таго, як актыўнасць сігналізацыі GA рэгулюе гэты клеткавы параметр.PE можа ўзаемадзейнічаць з бялковымі комплексамі перад згортваннем41, таму сігналізацыя GA можа рэгуляваць арыентацыю плоскасці дзялення клетак, непасрэдна ўплываючы на арыентацыю коркавых мікратрубачак40,41,54,55. Мы нечакана паказалі, што ў SAM карэлятам больш высокай актыўнасці сігналізацыі GA было не падаўжэнне або дзяленне клетак, а толькі анізатрапія росту, што адпавядае прамому ўздзеянню GA на кірунак дзялення клетак у IPR. Аднак мы не можам выключыць, што гэты эфект можа быць і ўскосным, напрыклад, апасродкаваным размякчэннем клеткавай сценкі, выкліканым GA56. Змены ўласцівасцей клеткавай сценкі выклікаюць механічнае напружанне57,58, якое таксама можа ўплываць на арыентацыю плоскасці дзялення клетак, уплываючы на арыентацыю коркавых мікратрубачак39,46,59. Сукупны эфект механічнага напружання, выкліканага GA, і прамой рэгуляцыі арыентацыі мікратрубачак з дапамогай GA можа быць уцягнуты ў фарміраванне спецыфічнага заканамернасці арыентацыі дзялення клетак у IPR для вызначэння міжвузлоў, і для праверкі гэтай ідэі неабходныя далейшыя даследаванні. Падобным чынам, папярэднія даследаванні падкрэслілі важнасць бялкоў TCP14 і 15, якія ўзаемадзейнічаюць з DELL, у кантролі фарміравання міжвузлоў60,61, і гэтыя фактары могуць апасродкаваць дзеянне GA разам з BREVIPEDICELLUS (BP) і PENNYWISE (PNY), якія рэгулююць развіццё міжвузлоў і, як было паказана, уплываюць на сігналізацыю GA2,62. Улічваючы, што ДЭЛА ўзаемадзейнічаюць з сігнальнымі шляхамі брасінастэроідаў, этылену, жасманавай кіслаты і абсцызавай кіслаты (АБК)63,64 і што гэтыя гармоны могуць уплываць на арыентацыю мікратрубачак65, уплыў ГК на арыентацыю дзялення клетак можа таксама апасродкавацца іншымі гармонамі.
Раннія цыталагічныя даследаванні паказалі, што як унутраныя, так і знешнія вобласці SAM Arabidopsis неабходныя для развіцця міжвузлоў2,42. Той факт, што GA актыўна рэгулюе дзяленне клетак ва ўнутраных тканінах12, падтрымлівае двайную функцыю GA ў рэгуляванні памеру мерыстэмы і міжвузлоў у SAM. Характар накіраванага дзялення клетак таксама строга рэгулюецца ва ўнутранай тканіне SAM, і гэтая рэгуляцыя неабходная для росту сцябла52. Будзе цікава вывучыць, ці гуляе GA таксама ролю ў арыентацыі плоскасці дзялення клетак ва ўнутранай арганізацыі SAM, тым самым сінхранізуючы спецыфікацыю і развіццё міжвузлоў унутры SAM.
Расліны вырошчвалі in vitro ў глебе або на асяроддзі 1x Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) з даданнем 1% цукрозы і 1% агару (Sigma) у стандартных умовах (16 гадзін асвятлення, 22 °C), за выключэннем эксперыментаў па гіпакатылю і росту каранёў, у якіх расаду вырошчвалі на вертыкальных пласцінах пры пастаянным асвятленні і 22 °C. Для эксперыментаў з нітратамі расліны вырошчвалі на мадыфікаваным асяроддзі MS (plant medium bioWORLD), даданым дастатковай колькасцю нітратаў (0 або 10 мМ KNO3), 0,5 мМ NH4-сукцыната, 1% цукрозы і 1% А-агару (Sigma) ва ўмовах доўгага дня.
кДНК GID1a, устаўленая ў pDONR221, была рэкамбінавана з pDONR P4-P1R-pUBQ10 і pDONR P2R-P3-mCherry ў pB7m34GW для атрымання pUBQ10::GID1a-mCherry. ДНК IDD2, устаўленая ў pDONR221, была рэкамбінавана ў pB7RWG266 для атрымання p35S:IDD2-RFP. Для стварэння pGID1b::2xmTQ2-GID1b спачатку ампліфікавалі фрагмент памерам 3,9 кб перад кадуючай вобласцю GID1b і фрагмент памерам 4,7 кб, які змяшчае кДНК GID1b (1,3 кб) і тэрмінатар (3,4 кб), з выкарыстаннем праймераў, паказаных у Дадатковай табліцы 3, а затым уставілі ў pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) і pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) адпаведна, і, нарэшце, рэкамбінавалі з pDONR221 2xmTQ268 у мэтавы вектар pGreen 012567 з выкарыстаннем кланавання Gateway. Для атрымання pCUC2::LSSmOrange паслядоўнасць прамотара CUC2 (3229 пар асноў перад ATG), а затым кадуючая паслядоўнасць вялікага mOrange са зрухам Стокса (LSSmOrange)69 з сігналам ядзернай лакалізацыі N7 і транскрыпцыйным тэрмінатарам NOS былі сабраны ў вектар-таргетынг канаміцыну pGreen з выкарыстаннем сістэмы рэкамбінацыі 3-фрагментаў Gateway (Invitrogen). Бінарны вектар для раслін быў уведзены ў штам Agrobacterium tumefaciens GV3101 і ўведзены ў лісце Nicotiana benthamiana метадам інфільтрацыі Agrobacterium і ў Arabidopsis thaliana Col-0 метадам апускання ў кветкавыя клеткі адпаведна. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry і pCLV3::mCherry-NLS qmRGA былі выдзелены з нашчадкаў F3 і F1 адпаведных скрыжаванняў адпаведна.
РНК-гібрыдызацыя in situ была праведзена на кончыках парасткаў даўжынёй прыблізна 1 см72, якія былі сабраны і неадкладна фіксаваны ў растворы FAA (3,7% фармальдэгіду, 5% воцатнай кіслаты, 50% этанолу), папярэдне астуджаным да 4 °C. Пасля 2 × 15 хвілін вакуумнай апрацоўкі фіксатар быў зменены, і ўзоры інкубаваліся на працягу ночы. кДНК GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 і RGL3 і антысэнсавыя зонды да іх 3'-UTR былі сінтэзаваны з выкарыстаннем праймераў, паказаных у дадатковай табліцы 3, як апісана Розье і інш.73. Дыгаксігенінам пазначаныя зонды імунадэтэктавалі з выкарыстаннем антыцелаў да дыгаксігеніну (3000-кратнае развядзенне; Roche, нумар у каталогу: 11 093 274 910), а зрэзы афарбоўвалі растворам 5-бром-4-хлор-3-індолілфасфату (BCIP, 250-кратнае развядзенне)/нітрасіняга тэтразолію (NBT, 200-кратнае развядзенне).
Час публікацыі: 10 лютага 2025 г.