Рост апікальнай мерыстэмы ўцёкаў (SAM) мае вырашальнае значэнне для архітэктуры сцябла. Раслінныя гармоныгіберэліны(GA) гуляюць ключавую ролю ў каардынацыі росту раслін, але іх роля ў SAM застаецца недастаткова вывучанай. Тут мы распрацавалі рацыяметрычны біясенсар перадачы сігналаў GA, распрацаваўшы бялок DELLA для падаўлення яго важнай рэгулятарнай функцыі ў транскрыпцыйным адказе GA, захоўваючы пры гэтым яго дэградацыю пры распазнаванні GA. Мы дэманструем, што гэты біядатчык, заснаваны на дэградацыі, дакладна рэгіструе змены ва ўзроўні ГА і клеткавага зандзіравання падчас распрацоўкі. Мы выкарыстоўвалі гэты біядатчык для адлюстравання сігнальнай актыўнасці GA ў SAM. Мы паказваем, што высокія сігналы GA прысутнічаюць пераважна ў клетках, размешчаных паміж зачаткамі органаў, якія з'яўляюцца папярэднікамі клетак міжвузелляў. Выкарыстоўваючы падыходы ўзмацнення і страты функцыі, мы дадаткова дэманструем, што GA рэгулюе арыентацыю плоскасці дзялення клеткі, усталёўваючы кананічную клеткавую арганізацыю міжвузелляў, тым самым спрыяючы спецыфікацыі міжвузелляў у SAM.
Апікальная мерыстэма ўцёкаў (SAM), размешчаная на верхавіне ўцёкаў, утрымлівае нішу ствалавых клетак, актыўнасць якіх стварае бакавыя органы і ствалавыя вузлы ў модульнай і ітэрацыйнай манеры на працягу ўсяго жыцця расліны. Кожная з гэтых паўтаральных адзінак або вузлоў расліны ўключае міжвузеллі і бакавыя органы ў вузлах, а таксама пазушныя мерыстэмы ў пазухах лісця1. Рост і арганізацыя вузлоў раслін змяняецца ў працэсе развіцця. У Arabidopsis рост міжвузелляў прыгнечаны на вегетатыўнай стадыі, і пазушныя мерыстэмы застаюцца ў стане спакою ў пазухах разеткавых лісця. Падчас пераходу да кветкавай фазы SAM становіцца мерыстэмай суквецці, утвараючы падоўжаныя міжвузеллі і пазушныя ныркі, галінкі ў пазухах сцябловага лісця, а пазней і бязлісцевыя кветкі2. Нягледзячы на тое, што мы дасягнулі значнага прагрэсу ў разуменні механізмаў, якія кантралююць ініцыяцыю лісця, кветак і галін, адносна мала вядома пра тое, як узнікаюць міжвузеллі.
Разуменне прасторава-часовага размеркавання ГА дапаможа лепш зразумець функцыі гэтых гармонаў у розных тканінах і на розных стадыях развіцця. Візуалізацыя дэградацыі зліцця RGA-GFP, выяўленая пад дзеяннем уласнага промотора, дае важную інфармацыю аб рэгуляцыі агульных узроўняў GA ў roots15,16. Аднак экспрэсія RGA вар'іруецца ў розных тканях17 і рэгулюецца GA18. Такім чынам, дыферэнцыяльная экспрэсія прамотара RGA можа прывесці да карціны флуарэсцэнцыі, якая назіраецца з RGA-GFP, і, такім чынам, гэты метад не з'яўляецца колькасным. Зусім нядаўна біяактыўны флуоресцеин (Fl), пазначаны GA19,20, выявіў назапашванне GA ў эндакартэксе кораня і рэгуляцыю яго клеткавых узроўняў транспартам GA. Нядаўна датчык GA FRET nlsGPS1 паказаў, што ўзроўні GA карэлююць з падаўжэннем клетак у каранях, нітках і цёмных гіпакатылях21. Аднак, як мы бачылі, канцэнтрацыя GA - не адзіны параметр, які кантралюе актыўнасць сігналізацыі GA, паколькі яна залежыць ад складаных працэсаў адчування. Тут, абапіраючыся на наша разуменне сігнальных шляхоў DELLA і GA, мы паведамляем аб распрацоўцы і характарызацыі рацыяметрычнага біясенсара на аснове дэградацыі для перадачы сігналаў GA. Для распрацоўкі гэтага колькаснага біясенсара мы выкарысталі мутантны GA-адчувальны RGA, які быў зліты з флуоресцентным бялком і паўсюдна экспрессировался ў тканінах, а таксама GA-неадчувальны флуоресцентный бялок. Мы паказваем, што мутантныя бялковыя зліцці RGA не перашкаджаюць эндагеннай перадачы сігналаў GA пры паўсюднай экспрэсіі і што гэты біядатчык можа колькасна вызначаць сігнальную актыўнасць у выніку ўваходу GA і апрацоўкі сігналу GA сэнсарным апаратам з высокім прасторава-часавым дазволам. Мы выкарыстоўвалі гэты біядатчык для адлюстравання прасторава-часовага размеркавання сігнальнай актыўнасці GA і колькаснай ацэнкі таго, як GA рэгулюе паводзіны клетак у эпідэрмісе SAM. Мы дэманструем, што GA рэгулюе арыентацыю плоскасці дзялення клетак SAM, размешчаных паміж зачаткамі органаў, тым самым вызначаючы кананічную клеткавую арганізацыю міжвузеллі.
Нарэшце, мы спыталі, ці можа qmRGA паведамляць аб зменах у эндагенных узроўнях ГА з дапамогай растучых гіпакатыляў. Раней мы паказалі, што нітрат стымулюе рост шляхам павелічэння сінтэзу ГА і, у сваю чаргу, дэградацыі DELLA34. Адпаведна, мы заўважылі, што даўжыня гіпакатыля ў саджанцаў pUBQ10::qmRGA, выгадаваных ва ўмовах багатага забеспячэння нітратамі (10 мМ NO3−), была значна большай, чым у саджанцаў, вырашчаных ва ўмовах дэфіцыту нітратаў (дадатковая мал. 6а). У адпаведнасці з рэакцыяй росту сігналы GA былі вышэй у гіпакатылях расады, выгадаваных ва ўмовах 10 мМ NO3−, чым у расады, выгадаванай у адсутнасць нітратаў (дадатковая мал. 6b, c). Такім чынам, qmRGA таксама дазваляе кантраляваць змены ў сігналізацыі GA, выкліканыя эндагеннымі зменамі ў канцэнтрацыі GA.
Каб зразумець, ці залежыць сігнальная актыўнасць GA, выяўленая з дапамогай qmRGA, ад канцэнтрацыі GA і ўспрымання GA, як чакалася зыходзячы з канструкцыі датчыка, мы прааналізавалі экспрэсію трох рэцэптараў GID1 у вегетатыўных і рэпрадуктыўных тканінах. У саджанцаў лінія рэпарцёра GID1-GUS паказала, што GID1a і c былі моцна выяўленыя ў семядолях (мал. 3a-c). Акрамя таго, усе тры рэцэптары былі выяўлены ў лісці, бакавых зачатках каранёў, кончыках каранёў (за выключэннем каранёвага каўпачка GID1b) і сасудзістай сістэме (мал. 3a-c). У суквецці SAM мы выявілі сігналы GUS толькі для GID1b і 1c (дадатковы мал. 7a–c). Гібрыдызацыя in situ пацвердзіла гэтыя мадэлі экспрэсіі і дадаткова прадэманстравала, што GID1c раўнамерна экспрэсіўна на нізкіх узроўнях у SAM, у той час як GID1b паказаў больш высокую экспрэсію на перыферыі SAM (дадатковы мал. 7d–l). Трансляцыйнае зліццё pGID1b::2xmTQ2-GID1b таксама выявіла градуяваны дыяпазон экспрэсіі GID1b, ад нізкай экспрэсіі або адсутнасці яе ў цэнтры SAM да высокай экспрэсіі на межах органаў (дадатковы мал. 7m). Такім чынам, рэцэптары GID1 нераўнамерна размеркаваны па тканінах і ўнутры іх. У наступных эксперыментах мы таксама заўважылі, што залішняя экспрэсія GID1 (pUBQ10 :: GID1a-mCherry) павялічвае адчувальнасць qmRGA ў гіпакатылях да вонкавага прымянення GA (мал. 3d, e). Наадварот, флуарэсцэнцыя, вымераная qd17mRGA ў гіпакатылі, была неадчувальнай да лячэння GA3 (мал. 3f, g). Для абодвух аналізаў расаду апрацоўвалі высокімі канцэнтрацыямі GA (100 мкМ GA3), каб ацаніць хуткае паводзіны датчыка, дзе здольнасць звязвацца з рэцэптарам GID1 павялічвалася або гублялася. Разам гэтыя вынікі пацвярджаюць, што біясенсар qmRGA выконвае камбінаваную функцыю датчыка GA і GA, і мяркуюць, што дыферэнцыяльная экспрэсія рэцэптара GID1 можа значна мадуляваць каэфіцыент выпраменьвання датчыка.
На сённяшні дзень размеркаванне сігналаў GA ў SAM застаецца незразумелым. Такім чынам, мы выкарыстоўвалі расліны, якія экспрэсуюць qmRGA, і рэпарцёр ствалавых клетак pCLV3 :: mCherry-NLS35 для разліку колькасных карт сігнальнай актыўнасці GA з высокім дазволам, засяродзіўшы ўвагу на слоі L1 (эпідэрміс; мал. 4a, b, гл. Метады і дадатковыя метады), паколькі L1 гуляе ключавую ролю ў кантролі росту SAM36. Тут pCLV3 :: mCherry-NLS выраз забяспечыў фіксаваную геаметрычную кропку адліку для аналізу прасторава-часовага размеркавання сігнальнай дзейнасці GA37. Нягледзячы на тое, што GA лічыцца неабходным для развіцця бакавых органаў4, мы заўважылі, што сігналы GA былі нізкімі ў кветкавым прымордыуме (P), пачынаючы са стадыі P3 (мал. 4a, b), у той час як маладыя прымордыі P1 і P2 мелі ўмераную актыўнасць, падобную да актыўнасці ў цэнтральнай вобласці (мал. 4a, b). Больш высокая сігнальная актыўнасць GA была выяўлена на межах зачатка органа, пачынаючы з P1/P2 (па баках мяжы) і дасягаючы максімуму на P4, а таксама ва ўсіх клетках перыферычнай вобласці, размешчанай паміж зачаткам (мал. 4a, b і дадатковыя мал. 8a, b). Гэтая больш высокая сігнальная актыўнасць GA назіралася не толькі ў эпідэрмісе, але таксама ў L2 і верхніх L3 пластах (дадатковы мал. 8b). Шаблон сігналаў GA, выяўленых у SAM з дапамогай qmRGA, таксама заставаўся нязменным з цягам часу (дадатковы малюнак 8c–f, k). Хоць канструкцыя qd17mRGA сістэматычна зніжалася ў SAM раслін T3 з пяці незалежных ліній, якія мы дэталёва ахарактарызавалі, мы змаглі прааналізаваць карціны флуарэсцэнцыі, атрыманыя з канструкцыяй pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (дадатковы малюнак 8g–j, l). У гэтай кантрольнай лініі ў SAM былі выяўлены толькі нязначныя змены каэфіцыента флуарэсцэнцыі, але ў цэнтры SAM мы назіралі відавочнае і нечаканае зніжэнне VENUS, звязанага з TagBFP. Гэта пацвярджае, што сігнальная карціна, якую назірае qmRGA, адлюстроўвае GA-залежную дэградацыю mRGA-VENUS, але таксама паказвае, што qmRGA можа пераацэньваць сігнальную актыўнасць GA ў цэнтры мерыстэмы. Такім чынам, нашы вынікі паказваюць сігналізацыю GA, якая ў першую чаргу адлюстроўвае размеркаванне зачаткаў. Такое размеркаванне межпримордиальной вобласці (IPR) адбываецца з-за паступовага ўсталявання высокай сігнальнай актыўнасці GA паміж развіваецца примордиумом і цэнтральнай вобласцю, у той час як у той жа час сігнальная актыўнасць GA ў примордиуме зніжаецца (мал. 4c, d).
Размеркаванне рэцэптараў GID1b і GID1c (гл. вышэй) сведчыць аб тым, што дыферэнцыяльная экспрэсія рэцэптараў GA дапамагае сфарміраваць структуру сігнальнай актыўнасці GA ў SAM. Нам было цікава, ці можа быць уцягнута дыферэнцыяльнае назапашванне ГА. Каб даследаваць гэтую магчымасць, мы выкарысталі датчык nlsGPS1 GA FRET21. Падвышаная частата актывацыі была выяўлена ў SAM nlsGPS1, апрацаванага 10 мкМ GA4+7 на працягу 100 хвілін (дадатковы малюнак 9a–e), што паказвае на тое, што nlsGPS1 рэагуе на змены канцэнтрацыі GA ў SAM, як гэта адбываецца ў roots21. Прасторавае размеркаванне частоты актывацыі nlsGPS1 выявіла адносна нізкія ўзроўні GA ў вонкавых пластах SAM, але паказала, што яны былі павышаны ў цэнтры і на межах SAM (мал. 4e і дадатковыя малюнкі 9a,c). Гэта сведчыць аб тым, што GA таксама размяркоўваецца ў SAM з прасторавай карцінай, параўнальнай з той, якую выяўляе qmRGA. У якасці дадатковага падыходу мы таксама разглядалі SAM з люмінесцэнтным GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) або толькі Fl у якасці адмоўнага кантролю. Сігнал Fl быў размеркаваны па ўсім SAM, уключаючы цэнтральную вобласць і прымордый, хоць і з меншай інтэнсіўнасцю (мал. 4j і дадатковы малюнак 10d). Наадварот, усе тры GA-Fl назапашваліся менавіта ў межах межаў прымордыя і ў рознай ступені ў астатняй частцы IPR, прычым GA7-Fl назапашваўся ў самым вялікім дамене ў IPR (мал. 4k і дадатковыя мал. 10a, b). Колькасная ацэнка інтэнсіўнасці флуарэсцэнцыі паказала, што стаўленне інтэнсіўнасці IPR да не-IPR было вышэй у SAM, апрацаваным GA-Fl, у параўнанні з SAM, апрацаваным Fl (мал. 4l і дадатковы малюнак 10c). Разам гэтыя вынікі паказваюць, што GA прысутнічае ў больш высокіх канцэнтрацыях у клетках IPR, якія размешчаны бліжэй за ўсё да мяжы органа. Гэта сведчыць аб тым, што структура сігнальнай актыўнасці SAM GA з'яўляецца вынікам як дыферэнцыяльнай экспрэсіі рэцэптараў GA, так і дыферэнцыяльнага назапашвання GA ў клетках IPR паблізу межаў органа. Такім чынам, наш аналіз выявіў нечаканы прасторава-часавы ўзор перадачы сігналаў GA з больш нізкай актыўнасцю ў цэнтры і прымордыуме SAM і больш высокай актыўнасцю ў IPR у перыферыйнай вобласці.
Каб зразумець ролю дыферэнцыяльнай сігнальнай актыўнасці GA ў SAM, мы прааналізавалі карэляцыю паміж сігнальнай актыўнасцю GA, пашырэннем клетак і дзяленнем клетак з дапамогай пакадравай візуалізацыі SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS у рэжыме рэальнага часу. Улічваючы ролю GA ў рэгуляцыі росту, чакалася станоўчая карэляцыя з параметрамі клеткавага пашырэння. Такім чынам, мы спачатку параўналі карты сігнальнай актыўнасці GA з картамі хуткасці росту клетачнай паверхні (у якасці проксі для сілы пашырэння клетак для дадзенай клеткі і для даччыных клетак пры дзяленні) і з картамі анізатрапіі росту, якая вымярае накіраванасць пашырэння клетак (таксама выкарыстоўваецца тут для дадзенай клеткі і для даччыных клетак пры дзяленні; мал. 5a,b, гл. Метады і дадатковыя метады). Нашы карты хуткасці росту клетачнай паверхні SAM адпавядаюць папярэднім назіранням 38,39, з мінімальнымі тэмпамі росту на мяжы і максімальнымі тэмпамі росту ў развіваюцца кветках (мал. 5а). Аналіз асноўных кампанентаў (PCA) паказаў, што сігнальная актыўнасць GA адмоўна карэлюе з інтэнсіўнасцю росту клетачнай паверхні (малюнак 5c). Мы таксама паказалі, што асноўныя восі варыяцый, у тым ліку сігнальны ўваход GA і інтэнсіўнасць росту, былі артаганальныя кірунку, вызначанаму высокай экспрэсіяй CLV3, што пацвярджае выключэнне клетак з цэнтра SAM у астатніх аналізах. Карэляцыйны аналіз Спірмена пацвердзіў вынікі PCA (малюнак 5d), паказваючы, што больш высокія сігналы GA ў IPR не прывялі да большага пашырэння клетак. Аднак карэляцыйны аналіз выявіў невялікую станоўчую карэляцыю паміж сігнальнай актыўнасцю GA і анізатрапіяй росту (малюнак 5c, d), што сведчыць аб тым, што больш высокая сігналізацыя GA ў IPR ўплывае на кірунак росту клетак і, магчыма, на становішча плоскасці дзялення клетак.
a, b Цеплавыя карты сярэдняга росту паверхні (a) і анізатрапіі росту (b) у SAM, асераднёныя па сямі незалежных раслінах (выкарыстоўваюцца ў якасці проксі для сілы і напрамку пашырэння клетак адпаведна). c Аналіз PCA уключаў наступныя зменныя: сігнал GA, інтэнсіўнасць росту паверхні, анізатрапію росту паверхні і экспрэсію CLV3. Кампанент PCA 1 у асноўным адмоўна карэляваў з інтэнсіўнасцю росту паверхні і станоўча карэляваў з сігналам GA. Кампанент PCA 2 у асноўным станоўча карэляваў з анізатрапіяй росту паверхні і адмоўна карэляваў з экспрэсіяй CLV3. Працэнты ўяўляюць варыяцыі, якія тлумачацца кожным кампанентам. d Аналіз карэляцыі Спірмена паміж сігналам GA, інтэнсіўнасцю росту паверхні і анізатрапіяй росту паверхні ў маштабе тканіны, за выключэннем CZ. Лік справа - гэта значэнне ро Спірмена паміж дзвюма зменнымі. Зорачкамі пазначаны выпадкі, калі карэляцыя/адмоўная карэляцыя вельмі значная. e 3D-візуалізацыя клетак Col-0 SAM L1 метадам канфакальнай мікраскапіі. Новыя клеткавыя сценкі, утвораныя ў SAM (але не прымордый) праз 10 гадзін, афарбоўваюцца ў адпаведнасці з іх вуглавымі значэннямі. Каляровая паласа паказваецца ў правым ніжнім куце. На ўстаўцы паказаны адпаведны 3D-малюнак у 0 гадзін. Эксперымент паўтаралі двойчы з аналагічнымі вынікамі. f На дыяграмах у скрынцы паказаны хуткасці дзялення клетак у IPR і без IPR Col-0 SAM (n = 10 незалежных раслін). Цэнтральная лінія паказвае медыяну, а межы рамкі паказваюць 25-ы і 75-ы працэнтылі. Вусы паказваюць мінімальныя і максімальныя значэнні, вызначаныя з дапамогай праграмнага забеспячэння R. Значэнні P былі атрыманы з дапамогай двухбаковага t-крытэрыю Уэлча. g, h Схематычная дыяграма, якая паказвае (g), як вымераць вугал новай клетачнай сценкі (пурпурны колер) адносна радыяльнага напрамку ад цэнтра SAM (белая пункцірная лінія) (разглядаюцца толькі значэнні вострага вугла, г.зн. 0–90°), і (h) акружны/бакавы і радыяльны напрамкі ўнутры мерыстэмы. я Частотныя гістаграмы арыентацыі плоскасці дзялення клетак па SAM (цёмна-сіні), IPR (сярэдне-сіні) і не-IPR (светла-сіні) адпаведна. Значэнні Р былі атрыманы з дапамогай двухбаковага тэсту Калмагорава-Смірнова. Эксперымент паўтаралі двойчы з аналагічнымі вынікамі. j Частотныя гістаграмы арыентацыі плоскасці клеткавага дзялення IPR вакол P3 (светла-зялёны), P4 (сярэдне-зялёны) і P5 (цёмна-зялёны), адпаведна. Значэнні Р былі атрыманы з дапамогай двухбаковага тэсту Калмагорава-Смірнова. Эксперымент паўтаралі двойчы з аналагічнымі вынікамі.
Такім чынам, далей мы даследавалі карэляцыю паміж перадачай сігналаў GA і актыўнасцю дзялення клетак шляхам вызначэння новаўтвораных клеткавых сценак падчас аналізу (мал. 5e). Такі падыход дазволіў вымераць частату і кірунак дзялення клетак. Дзіўна, але мы выявілі, што частата клеткавых дзяленняў у IPR і астатняй частцы SAM (не-IPR, мал. 5f) была падобнай, што паказвае на тое, што адрозненні ў сігналізацыі GA паміж клеткамі IPR і не-IPR істотна не ўплываюць на дзяленне клетак. Гэта, а таксама станоўчая карэляцыя паміж перадачай сігналаў GA і анізатрапіі росту, заахвоцілі нас разгледзець, ці можа сігнальная актыўнасць GA паўплываць на арыентацыю плоскасці дзялення клетак. Мы вымералі арыентацыю новай клеткавай сценкі ў выглядзе вострага вугла адносна радыяльнай восі, якая злучае цэнтр мерыстэмы і цэнтр новай клеткавай сценкі (мал. 5e-i), і назіралі відавочную тэндэнцыю клетак дзяліцца пад вугламі, блізкімі да 90° адносна радыяльнай восі, з самымі высокімі частотамі, якія назіраліся пры 70-80° (23,28%) і 80-90°. (22,62%) (мал. 5e,i), што адпавядае дзяленням клетак у акружным/папярочным кірунку (мал. 5h). Для вывучэння ўкладу перадачы сігналаў GA ў паводзіны дзялення клетак мы прааналізавалі параметры дзялення клетак у IPR і без IPR асобна (мал. 5i). Мы заўважылі, што размеркаванне вугла дзялення ў клетках IPR адрознівалася ад размеркавання вуглоў дзялення ў клетках без IPR або ў клетках усяго SAM, прычым клеткі IPR дэманструюць больш высокую долю бакавых/кругавых клеткавых дзяленняў, г.зн. 70-80° і 80-90° (33,86% і 30,71%, адпаведна, адпаведныя прапорцыі) (мал. 5i). Такім чынам, нашы назіранні выявілі сувязь паміж высокай перадачай сігналаў GA і арыентацыяй плоскасці дзялення клетак, блізкай да акружнага кірунку, падобна карэляцыі паміж сігнальнай актыўнасцю GA і анізатрапіі росту (мал. 5c, d). Для далейшага ўстанаўлення прасторавага захавання гэтай асацыяцыі мы вымералі арыентацыю плоскасці дзялення ў клетках IPR, навакольных прымордый, пачынаючы з P3, так як самая высокая сігнальная актыўнасць GA была выяўлена ў гэтай вобласці, пачынаючы з P4 (мал. 4). Куты дзялення IPR вакол P3 і P4 не паказалі статыстычна значных адрозненняў, хоць павелічэнне частоты бакавых дзяленняў клетак назіралася ў IPR вакол P4 (мал. 5j). Аднак у клетках IPR вакол P5 розніца ў арыентацыі плоскасці клеткавага дзялення стала статыстычна значнай з рэзкім павелічэннем частоты папярочных клеткавых дзяленняў (мал. 5j). Разам гэтыя вынікі сведчаць аб тым, што сігналізацыя GA можа кантраляваць арыентацыю клеткавых дзяленняў у SAM, што супадае з папярэднімі паведамленнямі 40,41 аб тым, што высокая сігналізацыя GA можа выклікаць бакавую арыентацыю клеткавых дзяленняў у IPR.
Мяркуецца, што клеткі ў IPR не будуць уключаны ў зачаткі, а хутчэй у міжвузеллі2,42,43. Папярочная арыентацыя клеткавых дзяленняў у ИПР можа прывесці да тыповай арганізацыі паралельных падоўжных шэрагаў клетак эпідэрмісу ў міжвузеллі. Нашы назіранні, апісаныя вышэй, сведчаць аб тым, што сігналізацыя GA, верагодна, гуляе ролю ў гэтым працэсе, рэгулюючы кірунак дзялення клетак.
Страта функцыі некалькіх генаў DELLA прыводзіць да канстытутыўнай рэакцыі GA, і дэла-мутанты могуць быць выкарыстаны для праверкі гэтай гіпотэзы44. Спачатку мы прааналізавалі патэрны экспрэсіі пяці генаў DELLA ў SAM. Транскрыпцыйнае зліццё лініі GUS45 паказала, што GAI, RGA, RGL1 і RGL2 (у значна меншай ступені) экспрэсіруюцца ў SAM (дадатковы малюнак 11a–d). Гібрыдызацыя in situ дадаткова прадэманстравала, што мРНК GAI назапашваецца менавіта ў зачатках і кветках, якія развіваюцца (дадатковы малюнак 11e). МРНК RGL1 і RGL3 былі выяўлены ва ўсім купале SAM і ў старых кветках, у той час як мРНК RGL2 было больш шмат у памежнай вобласці (дадатковы малюнак 11f–h). Канфакальная візуалізацыя pRGL3::RGL3-GFP SAM пацвердзіла экспрэсію, назіраную пры гібрыдызацыі in situ, і паказала, што бялок RGL3 назапашваецца ў цэнтральнай частцы SAM (дадатковы малюнак 11i). Выкарыстоўваючы лінію pRGA::GFP-RGA, мы таксама выявілі, што бялок RGA назапашваецца ў SAM, але яго колькасць памяншаецца на мяжы, пачынаючы з P4 (дадатковая мал. 11j). Характэрна, што мадэлі экспрэсіі RGL3 і RGA адпавядаюць больш высокай сігнальнай актыўнасці GA ў IPR, як выяўлена qmRGA (мал. 4). Больш за тое, гэтыя дадзеныя паказваюць, што ўсе DELLA выяўляюцца ў SAM і што іх выраз у сукупнасці ахоплівае ўвесь SAM.
Далей мы прааналізавалі параметры дзялення клетак у SAM дзікага тыпу (Ler, кантроль) і GAI-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 дэла пяці (глабальных) мутантаў (мал. 6а, б). Цікава, што мы назіралі статыстычна значны зрух у размеркаванні частот кута дзялення клетак у дэла глабальнага мутанта SAM у параўнанні з дзікім тыпам (мал. 6с). Гэта змяненне ў мутанта della global было абумоўлена павелічэннем частоты кутоў 80-90 ° (34,71% супраць 24,55%) і, у меншай ступені, кутоў 70-80 ° (23,78% супраць 20,18%), т. Е. Адпаведных папярочным дзяленням клетак (мал. 6в). Частата не папярочных дзяленняў (0-60 °) была таксама ніжэй у della global мутанта (мал. 6c). Частата папярочных дзяленняў клетак была значна павялічана ў SAM дэла глабальнага мутанта (мал. 6b). Частата папярочных дзяленняў клетак у IPR таксама была вышэй у мутанта della global у параўнанні з дзікім тыпам (мал. 6d). За межамі вобласці IPR дзікі тып меў больш раўнамернае размеркаванне кутоў дзялення клетак, у той час як мутант della global аддаваў перавагу тангенцыяльным дзяленням, такім як IPR (мал. 6e). Мы таксама колькасна ацанілі арыентацыю клеткавых дзяленняў у SAM пяцікратных мутантаў ga2-оксидазы (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 і ga2ox6-2), GA-неактыўнага мутантнага фону, у якім назапашваецца GA. У адпаведнасці з павелічэннем узроўняў GA, SAM пяцікратнага мутантнага суквецця ga2ox быў большым, чым у Col-0 (дадатковы мал. 12a, b), і ў параўнанні з Col-0 пяцікратны SAM ga2ox паказаў выразна іншае размеркаванне вуглоў дзялення клетак, з частатой вуглаў, якая павялічвалася ад 50° да 90°, г.зн. зноў у карысць датычныя дзялення (дадатковы мал. 12a-c). Такім чынам, мы паказваем, што канстытутыўныя актывацыя сігналізацыі GA і назапашванне GA выклікаюць бакавыя дзялення клетак у IPR і астатняй частцы SAM.
a, b 3D-візуалізацыя пласта L1 афарбаванага PI Лера (а) і глабальнага мутанта дэла (б) SAM з дапамогай канфакальнай мікраскапіі. Новыя клеткавыя сценкі, утвораныя ў SAM (але не прымордыум) на працягу 10-гадзіннага перыяду, паказаны і афарбаваны ў адпаведнасці з іх вуглавымі значэннямі. На ўстаўцы паказаны SAM у 0 гадзін. Каляровая паласа адлюстроўваецца ў правым ніжнім куце. Стрэлка ў (b) паказвае на прыклад выраўнаваных файлаў вочак у глабальным мутанце дэла. Эксперымент паўтаралі двойчы з аналагічнымі вынікамі. цэ параўнанне частотнага размеркавання арыентацый плоскасці дзялення клетак у цэлым SAM (d), IPR (e) і не-IPR (f) паміж Ler і global della. Значэнні Р былі атрыманы з дапамогай двухбаковага тэсту Калмагорава-Смірнова. f, g 3D-візуалізацыя канфакальных малюнкаў PI-афарбаваных SAM Col-0 (i) і pCUC2:: gai-1-VENUS (j) трансгенных раслін. Панэлі (а, б) паказваюць новыя клеткавыя сценкі (але не зародкі), якія ўтварыліся ў SAM на працягу 10 гадзін. Эксперымент паўтаралі двойчы з аналагічнымі вынікамі. h–j Параўнанне частотнага размеркавання арыентацый плоскасці дзялення клетак, размешчаных ва ўсім SAM (h), IPR (i) і не-IPR (j) паміж раслінамі Col-0 і pCUC2::gai-1-VENUS. Значэнні Р былі атрыманы з дапамогай двухбаковага тэсту Калмагорава-Смірнова.
Затым мы праверылі эфект інгібіравання перадачы сігналаў GA менавіта ў IPR. З гэтай мэтай мы выкарыстоўвалі промотор чашкі семядолі 2 (CUC2), каб кіраваць экспрэсіяй дамінантнага адмоўнага бялку gai-1, злітага з VENUS (у лініі pCUC2::gai-1-VENUS). У SAM дзікага тыпу прамоўтэр CUC2 кіруе экспрэсіяй большасці IPR у SAM, уключаючы памежныя клеткі, пачынаючы з P4, і аналагічная спецыфічная экспрэсія назіралася ў раслінах pCUC2::gai-1-VENUS (гл. ніжэй). Размеркаванне вуглоў дзялення клетак па SAM або IPR раслін pCUC2::gai-1-VENUS істотна не адрознівалася ад дзікага тыпу, хоць нечакана мы выявілі, што клеткі без IPR у гэтых раслінах дзяліліся з большай частатой 80–90° (мал. 6f–j).
Было выказана здагадка, што кірунак дзялення клетак залежыць ад геаметрыі SAM, у прыватнасці, ад напружання расцяжэння, выкліканага curvature46 тканіны. Таму мы спыталі, ці была зменена форма SAM у мутанта della global і раслін pCUC2::gai-1-VENUS. Як паведамлялася раней12, памер мутанта della global SAM быў большы, чым у дзікага тыпу (дадатковы мал. 13a, b, d). Гібрыдызацыя in situ РНК CLV3 і STM пацвердзіла пашырэнне мерыстэмы ў мутантаў дэла і дадаткова паказала бакавое пашырэнне нішы ствалавой клеткі (дадатковы малюнак 13e, f, h, i). Аднак скрыўленне SAM было аднолькавым у абодвух генатыпаў (дадатковая мал. 13k, m, n, p). Мы назіралі аналагічнае павелічэнне памеру ў чатырохкратнага мутанта gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della без змены крывізны ў параўнанні з дзікім тыпам (дадатковы малюнак 13c, d, g, j, l, o, p). Частата арыентацыі клеткавага дзялення таксама была закранута ў чатырохкратнага мутанта дэла, але ў меншай ступені, чым у маналітнага мутанта дэла (дадатковы мал. 12d-f). Гэты эфект дазоўкі разам з адсутнасцю ўплыву на скрыўленне сведчыць аб тым, што рэшткавая актыўнасць RGL3 у чатырохкратным мутанце Дэла абмяжоўвае змены ў арыентацыі дзялення клетак, выкліканыя стратай актыўнасці DELLA, і што змены ў бакавых дзяленнях клетак адбываюцца ў адказ на змены ў сігнальнай актыўнасці GA, а не на змены ў геаметрыі SAM. Як апісана вышэй, прамоўтэр CUC2 кіруе экспрэсіяй IPR у SAM, пачынаючы з P4 (дадатковы малюнак 14a, b), і, наадварот, pCUC2::gai-1-VENUS SAM меў паменшаны памер, але большую крывізну (дадатковы малюнак 14c–h). Гэта змяненне марфалогіі pCUC2::gai-1-VENUS SAM можа прывесці да іншага размеркавання механічных напружанняў у параўнанні з дзікім тыпам, у якім высокія акружныя напружання пачынаюцца на меншай адлегласці ад цэнтра SAM47. З іншага боку, змены ў марфалогіі pCUC2::gai-1-VENUS SAM могуць быць вынікам змяненняў у рэгіянальных механічных уласцівасцях, выкліканых экспрэсіяй трансгена48. У абодвух выпадках гэта можа часткова кампенсаваць наступствы змяненняў у перадачы сігналаў GA, павялічваючы верагоднасць таго, што клеткі будуць дзяліцца ў акружнай/папярочнай арыентацыі, тлумачачы нашы назіранні.
У сукупнасці нашы дадзеныя пацвярджаюць, што больш высокая сігналізацыя GA гуляе актыўную ролю ў бакавой арыентацыі плоскасці дзялення клетак у IPR. Яны таксама паказваюць, што крывізна мерыстэмы таксама ўплывае на арыентацыю плоскасці дзялення клеткі ў IPR.
Папярочная арыентацыя плоскасці дзялення ў IPR з-за высокай сігнальнай актыўнасці GA сведчыць аб тым, што GA папярэдне арганізуе радыяльны клеткавы файл у эпідэрмісе ўнутры SAM, каб вызначыць клеткавую арганізацыю, якая пазней будзе знойдзена ў эпідэрмальныя міжвузеллі. Сапраўды, такія файлы вочак часта былі бачныя на малюнках SAM дэла глабальных мутантаў (мал. 6b). Такім чынам, для далейшага вывучэння функцыі развіцця прасторавай схемы перадачы сігналаў GA ў SAM мы выкарыстоўвалі пакадравую візуалізацыю для аналізу прасторавай арганізацыі клетак у IPR у дзікага тыпу (Ler і Col-0), дэла-глабальных мутантаў і трансгенных раслін pCUC2::gai-1-VENUS.
Мы выявілі, што qmRGA паказаў, што сігнальная актыўнасць GA ў IPR павялічылася ад P1/P2 і дасягнула піка ў P4, і гэтая карціна заставалася пастаяннай з цягам часу (мал. 4a-f і дадатковыя малюнкі 8c-f, k). Каб прааналізаваць прасторавую арганізацыю клетак у IPR з павелічэннем сігналу GA, мы пазначылі клеткі Ler IPR вышэй і па баках ад P4 у адпаведнасці з іх лёсам у развіцці, прааналізаваным праз 34 гадзіны пасля першага назірання, г.зн. больш чым у два пластыдныя разы, што дазваляе нам сачыць за клеткамі IPR падчас развіцця прымордыя ад P1/P2 да P4. Мы выкарыстоўвалі тры розных колеру: жоўты для тых клетак, якія былі інтэграваныя ў прымордый каля P4, зялёны для тых, якія былі ў IPR, і фіялетавы для тых, якія ўдзельнічалі ў абодвух працэсах (мал. 7a-c). У t0 (0 гадзін), 1-2 пласта клетак IPR былі бачныя перад P4 (мал. 7а). Як і чакалася, калі гэтыя клеткі дзяліліся, яны рабілі гэта ў асноўным праз папярочную плоскасць дзялення (мал. 7a-c). Падобныя вынікі былі атрыманы пры выкарыстанні Col-0 SAM (засяродзіўшы ўвагу на P3, мяжа якога складваецца аналагічна P4 у Ler), хоць у гэтым генатыпе зморшчына, якая ўтварылася на кветкавай мяжы, хутчэй хавала клеткі IPR (мал. 7g-i). Такім чынам, мадэль дзялення клетак IPR загадзя арганізуе клеткі ў радыяльныя шэрагі, як у міжвузеллі. Арганізацыя радыяльных шэрагаў і лакалізацыя клетак IPR паміж паслядоўнымі органамі дазваляюць выказаць здагадку, што гэтыя клеткі з'яўляюцца межузловых папярэднікамі.
Тут мы распрацавалі рацыяметрычны сігнальны біядатчык GA, qmRGA, які дазваляе колькасна адлюстроўваць сігнальную актыўнасць GA ў выніку камбінаваных канцэнтрацый GA і рэцэптараў GA, адначасова зводзячы да мінімуму ўмяшанне ў эндагенныя сігнальныя шляхі, тым самым забяспечваючы інфармацыю аб функцыі GA на клеткавым узроўні. З гэтай мэтай мы пабудавалі мадыфікаваны бялок DELLA, mRGA, які страціў здольнасць звязваць партнёраў па ўзаемадзеянні DELLA, але застаецца адчувальным да протеолиза, выкліканага GA. qmRGA рэагуе як на экзагенныя, так і на эндагенныя змены ва ўзроўні GA, і яго ўласцівасці дынамічнага адчування дазваляюць ацаніць прасторава-часавыя змены ў сігнальнай актыўнасці GA падчас развіцця. qmRGA таксама з'яўляецца вельмі гнуткім інструментам, паколькі яго можна адаптаваць да розных тканін шляхам змены промотора, які выкарыстоўваецца для яго экспрэсіі (пры неабходнасці), і, улічваючы захаваны характар сігнальнага шляху GA і матыву PFYRE ў пакрытанасенных раслін, яго, верагодна, можна перанесці на іншыя віды22. У адпаведнасці з гэтым было паказана, што эквівалентная мутацыя ў рысавым бялку SLR1 DELLA (HYY497AAA) душыць актыўнасць рэпрэсара росту SLR1, адначасова толькі нязначна зніжаючы яго дэградацыю, апасродкаваную GA, падобна mRGA23. Характэрна, што нядаўнія даследаванні Arabidopsis паказалі, што адна амінакіслотная мутацыя ў дамене PFYRE (S474L) змяніла транскрыпцыйных актыўнасць RGA, не ўплываючы на яго здольнасць ўзаемадзейнічаць з партнёрамі транскрыпцыйнага фактару50. Хоць гэтая мутацыя вельмі блізкая да трох амінакіслотных замен, якія прысутнічаюць у mRGA, нашы даследаванні паказваюць, што гэтыя дзве мутацыі змяняюць розныя характарыстыкі DELLA. Хоць большасць фактараў транскрыпцыі-партнёраў звязваюцца з даменамі LHR1 і SAW DELLA26,51, некаторыя кансерватыўныя амінакіслоты ў дамене PFYRE могуць дапамагчы стабілізаваць гэтыя ўзаемадзеянні.
Развіццё міжвузлоў з'яўляецца ключавой рысай у архітэктуры раслін і паляпшэнні ўраджайнасці. qmRGA выявіў больш высокую актыўнасць сігналізацыі GA ў клетках-папярэдніках міжвузлоў IPR. Спалучаючы колькасную візуалізацыю і генетыку, мы паказалі, што сігнальныя патэрны GA накладваюць кругавыя/папярочныя плоскасці дзялення клетак у эпідэрмісе SAM, фарміруючы арганізацыю дзялення клетак, неабходную для развіцця міжвузлоў. Падчас развіцця было выяўлена некалькі рэгулятараў арыентацыі плоскасці дзялення клетак52,53. Наша праца дае выразны прыклад таго, як актыўнасць сігналізацыі GA рэгулюе гэты клеткавы параметр.PE можа ўзаемадзейнічаць з бялковымі комплексамі перад згортваннем41, таму сігналізацыя GA можа рэгуляваць арыентацыю плоскасці дзялення клетак, непасрэдна ўплываючы на арыентацыю коркавых мікратрубачак40,41,54,55. Мы нечакана паказалі, што ў SAM карэлятам больш высокай актыўнасці сігналізацыі GA было не падаўжэнне або дзяленне клетак, а толькі анізатрапія росту, што адпавядае прамому ўздзеянню GA на кірунак дзялення клетак у IPR. Аднак мы не можам выключыць, што гэты эфект можа быць і ўскосным, напрыклад, апасродкаваным размякчэннем клеткавай сценкі, выкліканым GA56. Змены ўласцівасцей клеткавай сценкі выклікаюць механічнае напружанне57,58, якое таксама можа ўплываць на арыентацыю плоскасці дзялення клетак, уплываючы на арыентацыю коркавых мікратрубачак39,46,59. Сукупны эфект механічнага напружання, выкліканага GA, і прамой рэгуляцыі арыентацыі мікратрубачак з дапамогай GA можа быць уцягнуты ў фарміраванне спецыфічнага заканамернасці арыентацыі дзялення клетак у IPR для вызначэння міжвузлоў, і для праверкі гэтай ідэі неабходныя далейшыя даследаванні. Падобным чынам, папярэднія даследаванні падкрэслілі важнасць бялкоў TCP14 і 15, якія ўзаемадзейнічаюць з DNA, у кантролі фарміравання міжвузлоў60,61, і гэтыя фактары могуць апасродкаваць дзеянне GA разам з BREVIPEDICELLUS (BP) і PENNYWISE (PNY), якія рэгулююць развіццё міжвузлоў і, як было паказана, уплываюць на сігналізацыю GA2,62. Улічваючы, што ДЭЛА ўзаемадзейнічаюць з сігнальнымі шляхамі брасінастэроідаў, этылену, жасманавай кіслаты і абсцызавай кіслаты (АБК)63,64 і што гэтыя гармоны могуць уплываць на арыентацыю мікратрубачак65, уплыў ГК на арыентацыю дзялення клетак можа таксама апасродкавацца іншымі гармонамі.
Раннія цыталагічныя даследаванні паказалі, што як унутраная, так і знешняя вобласці SAM Arabidopsis неабходныя для развіцця міжвузелляў 2,42. Той факт, што GA актыўна рэгулюе дзяленне клетак ва ўнутраных тканінах12, пацвярджае падвойную функцыю GA ў рэгуляванні мерыстэмы і памеру міжвузелляў у SAM. Патэрн накіраванага дзялення клетак таксама жорстка рэгулюецца ва ўнутранай тканіны SAM, і гэтая рэгуляцыя важная для росту ствала52. Будзе цікава вывучыць, ці гуляе GA таксама ролю ў арыентацыі плоскасці дзялення клетак ва ўнутранай арганізацыі SAM, тым самым сінхранізуючы спецыфікацыю і развіццё міжвузелляў у SAM.
Расліны вырошчвалі in vitro ў глебе або 1x асяроддзі Мурасіге-Скуга (MS) (Duchefa) з даданнем 1% цукрозы і 1% агару (Sigma) у стандартных умовах (16 гадзін святла, 22 °C), за выключэннем эксперыментаў па росце гіпакатыля і каранёў, у якіх расаду вырошчвалі на вертыкальных пласцінах пры пастаянным асвятленні і 22 °C. Для эксперыментаў з нітратамі расліны вырошчвалі на мадыфікаванай асяроддзі MS (расліннае асяроддзе bioWORLD), дапоўненай дастатковай колькасцю нітратаў (0 або 10 мМ KNO3), 0,5 мМ NH4-сукцыната, 1% цукрозы і 1% А-агара (Sigma) ва ўмовах доўгага дня.
кДНК GID1a, устаўленая ў pDONR221, была рэкамбінавана з pDONR P4-P1R-pUBQ10 і pDONR P2R-P3-mCherry у pB7m34GW для стварэння pUBQ10::GID1a-mCherry. ДНК IDD2, устаўленая ў pDONR221, была рэкамбінавана ў pB7RWG266 для стварэння p35S:IDD2-RFP. Каб згенераваць pGID1b::2xmTQ2-GID1b, фрагмент памерам 3,9 кб вышэй за вобласць кадавання GID1b і фрагмент памерам 4,7 кб, які змяшчае кДНК GID1b (1,3 кб) і тэрмінатар (3,4 кб), былі спачатку ампліфікаваны з выкарыстаннем праймераў у дадатковай табліцы 3, а затым устаўлены ў pDONR P4-P1R (Thermo Fisher). Scientific) і pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), адпаведна, і, нарэшце, рэкамбінаваны з pDONR221 2xmTQ268 у вектар-мішэнь pGreen 012567 з дапамогай кланавання Gateway. Каб стварыць pCUC2::LSSmOrange, паслядоўнасць промотора CUC2 (3229 п.о. перад ATG), за якой ішла паслядоўнасць кадавання вялікага mOrange са зрухам па Стоксу (LSSmOrange)69 з сігналам лакалізацыі ядра N7 і тэрмінатарам транскрыпцыі NOS, былі сабраны ў канаміцынавы вектар pGreen з выкарыстаннем 3-фрагментнай сістэмы рэкамбінацыі Gateway. (Invitrogen). Раслінны бінарны вектар быў уведзены ў штам Agrobacterium tumefaciens GV3101 і ўведзены ў лісце Nicotiana benthamiana метадам інфільтрацыі Agrobacterium і ў Arabidopsis thaliana Col-0 метадам апускання ў кветкі адпаведна. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry і pCLV3::mCherry-NLS qmRGA былі вылучаны з нашчадкаў F3 і F1 адпаведных скрыжаванняў адпаведна.
Гібрыдызацыю РНК in situ праводзілі на кончыках уцёкаў даўжынёй прыкладна 1 см72, якія збіралі і неадкладна фіксавалі ў растворы FAA (3,7% фармальдэгіду, 5% воцатнай кіслаты, 50% этанолу), папярэдне астуджаным да 4 °C. Пасля 2 × 15 хвілін вакуумнай апрацоўкі фіксатар змянялі і ўзоры інкубавалі на працягу ночы. КДНК GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 і RGL3 і антысэнсавыя зонды да іх 3'-UTR былі сінтэзаваны з выкарыстаннем праймераў, паказаных у дадатковай табліцы 3, як апісана Rosier et al.73. Зонды, пазначаныя дигоксигенином, імунна выяўлялі з выкарыстаннем антыцелаў да дигоксигенину (3000-кратнае развядзенне; Roche, нумар па каталогу: 11 093 274 910), а зрэзы афарбоўвалі 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфатом (BCIP, 250-кратнае развядзенне)/нитросиним тетразолием (NBT, 200-кратнае развядзенне) раствора.
Час публікацыі: 10 лютага 2025 г