ДЭЛА-бялкі кансерватыўныярэгулятары ростуякія адыгрываюць цэнтральную ролю ў развіцці раслін у адказ на ўнутраныя і знешнія сігналы. Як транскрыпцыйныя рэгулятары, ДЭЛА звязваюцца з транскрыпцыйнымі фактарамі (ТФ) і гістонам H2A праз свае GRAS-дамены і рэкрутуюцца для ўздзеяння на прамотары. Нядаўнія даследаванні паказалі, што стабільнасць ДЭЛА рэгулюецца посттрансляцыйна двума механізмамі: поліўбіквітынацыяй, індуцыраванай раслінным гармонамгіберелін, што прыводзіць да іх хуткай дэградацыі, і кан'югацыі з невялікім убіквіцін-падобным мадыфікатарам (SUMO), што павялічвае іх назапашванне. Больш за тое, актыўнасць ДЭЛА дынамічна рэгулюецца двума рознымі механізмамі гліказілявання: О-фуказіляванне ўзмацняе ўзаемадзеянне ДЭЛА-ТФ, тады як О-звязаная мадыфікацыя N-ацэтылглюказаміна (O-GlcNAc) інгібіруе ўзаемадзеянне ДЭЛА-ТФ. Аднак роля фасфаралявання ДЭЛА незразумелая, паколькі папярэднія даследаванні паказалі супярэчлівыя вынікі, прычым некаторыя мяркуюць, што фасфараляванне спрыяе або падаўляе дэградацыю ДЭЛА, а іншыя мяркуюць, што фасфараляванне не ўплывае на іх стабільнасць. Тут мы ідэнтыфікуем сайты фасфаралявання ў рэпрэсары GA1-3 (RGA), AtDELLA, ачышчаным з Arabidopsis thaliana метадам мас-спектрометрыі, і паказваем, што фасфараляванне двух пептыдаў RGA ў поліS- і поліS/Т-рэгіёнах павышае актыўнасць RGA, спрыяючы звязванню H2A і асацыяцыі RGA з мэтавымі прамотарамі. Прыкметна, што фасфараляванне не паўплывала на ўзаемадзеянне RGA-TF або стабільнасць RGA. Наша даследаванне раскрывае малекулярны механізм, з дапамогай якога фасфараляванне індукуе актыўнасць ДЭЛА.
Наш мас-спектрометрычны аналіз паказаў, што як Pep1, так і Pep2 былі высока фасфараляваныя ў RGA на фоне дэфіцыту GA1. Акрамя гэтага даследавання, фосфапратэомныя даследаванні таксама выявілі фасфараляванне Pep1 у RGA, хоць яго роля яшчэ не вывучана53,54,55. У адрозненне ад гэтага, фасфараляванне Pep2 раней не было апісана, паколькі гэты пептыд можна было выявіць толькі з дапамогай трансгена RGAGKG. Нягледзячы на тое, што мутацыя m1A, якая адмяніла фасфараляванне Pep1, толькі нязначна знізіла актыўнасць RGA ў раслінах, яна мела адытыўны эфект у спалучэнні з m2A ў зніжэнні актыўнасці RGA (Дадатковы малюнак 6). Важна адзначыць, што фасфараляванне Pep1 было значна зніжана ў мутанта sly1 з палепшаным GA ў параўнанні з ga1, што сведчыць аб тым, што GA спрыяе дэфасфараляванню RGA, зніжаючы яго актыўнасць. Механізм, з дапамогай якога GA падаўляе фасфараляванне RGA, патрабуе далейшага даследавання. Адной з магчымасцей з'яўляецца тое, што гэта дасягаецца шляхам рэгуляцыі неідэнтыфікаванай пратэінкіназы. Нягледзячы на тое, што даследаванні паказалі, што экспрэсія пратэінкіназы CK1 EL1 зніжаецца пад уздзеяннем GA ў рысе41, нашы вынікі паказваюць, што мутацыі вышэйшага парадку гомолага Arabidopsis EL1 (AEL1-4) не зніжаюць фасфараляванне RGA. У адпаведнасці з нашымі вынікамі, нядаўняе фосфапратэомнае даследаванне з выкарыстаннем ліній Arabidopsis з падвышанай экспрэсіяй AEL і патройнага мутанта ael не вызначыла ніякіх бялкоў PELL як субстратаў гэтых кіназ56. Калі мы рыхтавалі рукапіс, паведамлялася, што GSK3, ген, які кадуе GSK3/SHAGGY-падобную кіназу ў пшаніцы (Triticum aestivum), можа фасфараляваць PELL (Rht-B1b)57, хоць фасфараляванне Rht-B1b з дапамогай GSK3 не было пацверджана in planta. Ферментатыўныя рэакцыі in vitro ў прысутнасці GSK3 з наступным аналізам мас-спектрометрыі выявілі тры сайты фасфаралявання, размешчаныя паміж даменамі PELL і GRAS Rht-B1b (Дадатковы малюнак 3). Замяшчэнні серыну на аланін ва ўсіх трох сайтах фасфаралявання прывялі да зніжэння актыўнасці Rht-B1b у трансгеннай пшаніцы, што адпавядае нашым высновам аб тым, што замяшчэнні аланіна ў Pep2 RGA зніжаюць актыўнасць RGA. Аднак аналізы дэградацыі бялку in vitro дадаткова паказалі, што фасфараляванне таксама можа стабілізаваць Rht-B1b57. Гэта супярэчыць нашым вынікам, якія паказваюць, што замяшчэнні аланіна ў Pep2 RGA не змяняюць яго стабільнасць in planta. GSK3 у пшаніцы з'яўляецца арталагам брасінастэроід-неадчувальнага бялку 2 (BIN2) у Arabidopsis 57. BIN2 з'яўляецца негатыўным рэгулятарам сігналізацыі BR, і BR актывуе яго сігнальны шлях, выклікаючы дэградацыю BIN2 58. Мы паказалі, што апрацоўка BR не зніжае стабільнасць RGA 59 або ўзровень фасфаралявання ў Arabidopsis (Дадатковы малюнак 2), што сведчыць аб тым, што RGA наўрад ці будзе фасфараляваны BIN2.
Усе колькасныя дадзеныя былі статыстычна прааналізаваны з выкарыстаннем Excel, а значныя адрозненні былі вызначаны з дапамогай t-крытэрыя Стьюдэнта. Статыстычныя метады для папярэдняга вызначэння памеру выбаркі не выкарыстоўваліся. Ніякія дадзеныя не былі выключаны з аналізу; эксперымент не быў рандомізаваны; і даследчыкі ведалі пра размеркаванне падчас эксперыменту і ацэнкі вынікаў. Памеры выбаркі пададзены ў подпісах да малюнкаў і ў файлах з неапрацаванымі дадзенымі.
Час публікацыі: 15 красавіка 2025 г.