Сасновая нематода — гэта каранцінны мігруючы эндапаразіт, вядомы тым, што прычыняе сур'ёзныя эканамічныя страты ў экасістэмах сасновых лясоў. У гэтым даследаванні разглядаецца нематыцыдная актыўнасць галагенаваных індолаў супраць сасновых нематод і механізм іх дзеяння. Нематыцыдная актыўнасць 5-ёдаіндолу і авермектыну (станоўчы кантроль) супраць сасновых нематод была падобнай і высокай пры нізкіх канцэнтрацыях (10 мкг/мл). 5-ёдаіндол зніжаў пладавітасць, рэпрадуктыўную актыўнасць, эмбрыянальную і лічынкавую смяротнасць, а таксама рухальную паводзіны. Малекулярныя ўзаемадзеянні лігандаў са спецыфічнымі для беспазваночных глутамат-залежнымі хларыднымі каналамі пацвярджаюць меркаванне, што 5-ёдаіндол, як і авермектын, цесна звязваецца з актыўным цэнтрам рэцэптара. 5-ёдаіндол таксама выклікаў розныя фенатыпічныя дэфармацыі ў нематод, у тым ліку анамальны калапс/скарачэнне органаў і павелічэнне вакуалізацыі. Гэтыя вынікі сведчаць аб тым, што вакуолі могуць гуляць ролю ў смерці нематод, апасродкаванай метыляваннем. Важна адзначыць, што 5-ёдаіндол быў нетаксічны для абодвух відаў раслін (капусты і радыскі). Такім чынам, гэта даследаванне паказвае, што ўжыванне ёдаіндолу ў умовах навакольнага асяроддзя можа кантраляваць пашкоджанні, выкліканыя ўвяданнем хвоі.
Сасновая нематода (Bursaphelenchus xylophilus) належыць да сасновых нематод (PWN) — мігруючых эндапаразітычных нематод, вядомых тым, што наносяць сур'ёзную экалагічную шкоду экасістэмам хваёвых лясоў1. Хвароба ўвядання хвоі (PWD), выкліканая сасновай нематодай, становіцца сур'ёзнай праблемай на некалькіх кантынентах, у тым ліку ў Азіі і Еўропе, а ў Паўночнай Амерыцы нематода знішчае інтрадукаваныя віды хвоі1,2. Знішчэнне колькасці хвоі з'яўляецца сур'ёзнай эканамічнай праблемай, і перспектыва яе глабальнага распаўсюджвання выклікае занепакоенасць3. Наступныя віды хвоі часцей за ўсё падвяргаюцца нападу нематоды: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii і Pinus radiata4. Сасновая нематода — гэта сур'ёзнае захворванне, якое можа забіць хвоі на працягу тыдняў ці месяцаў пасля заражэння. Акрамя таго, успышкі сасновай нематоды распаўсюджаныя ў розных экасістэмах, таму былі ўсталяваныя ўстойлівыя ланцужкі інфекцыі1.
Bursaphelenchus xylophilus — каранцінны раслінны паразітычны нематод, які належыць да надсямейства Aphelenchoidea і клады 102.5. Нематода сілкуецца грыбамі і размнажаецца ў драўняных тканінах хвойных дрэў, развіваючыся ў чатыры розныя лічынкавыя стадыі: L1, L2, L3, L4 і дарослая асобіна1,6. Ва ўмовах дэфіцыту ежы хваёвая нематода пераходзіць у спецыялізаваную лічынкавую стадыю — дауэр, якая паразітуе на сваім пераносчыку — хваёвым караедзе (Monochamus alternatus) і пераносіцца на здаровыя хвоі. У здаровых гаспадароў нематоды хутка мігруюць па раслінных тканінах і сілкуюцца парэнхіматознымі клеткамі, што прыводзіць да шэрагу рэакцый гіперчувствітельносці, завядання і гібелі хвоі на працягу года пасля заражэння1,7,8.
Біялагічны кантроль хваёвых нематод доўгі час быў праблемай, а каранцінныя меры былі ўведзены яшчэ ў 20 стагоддзі. Сучасныя стратэгіі барацьбы з хваёвымі нематодамі ў асноўным ўключаюць хімічную апрацоўку, у тым ліку фумігацыю драўніны і імплантацыю нематоцыдаў у ствалы дрэў. Найбольш распаўсюджанымі нематоцыдамі з'яўляюцца авермектын і бензаат авермектыну, якія адносяцца да сямейства авермектынаў. Гэтыя дарагія хімікаты вельмі эфектыўныя супраць многіх відаў нематод і лічацца бяспечнымі для навакольнага асяроддзя9. Аднак чакаецца, што паўторнае выкарыстанне гэтых нематоцыдаў створыць селекцыйны ціск, які амаль напэўна прывядзе да з'яўлення ўстойлівых хваёвых нематод, як гэта было прадэманстравана для некалькіх насякомых-шкоднікаў, такіх як Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella і нематод Trichostrongylus colubriformis і Ostertagia circumcincta, якія паступова развілі ўстойлівасць да авермектынаў10,11,12. Такім чынам, неабходна рэгулярна вывучаць мадэлі ўстойлівасці і пастаянна правяраць нематоцыды, каб знайсці альтэрнатыўныя, эканамічна эфектыўныя і экалагічна бяспечныя меры барацьбы з PVD. У апошнія дзесяцігоддзі шэраг аўтараў прапанавалі выкарыстоўваць раслінныя экстракты, эфірныя алеі і лятучыя рэчывы ў якасці сродкаў барацьбы з нематодамі13,14,15,16.
Нядаўна мы прадэманстравалі нематыцыдную актыўнасць індолу, міжклеткавай і міжцарствавой сігнальнай малекулы, у Caenorhabditis elegans 17. Індол з'яўляецца шырока распаўсюджаным унутрыклеткавым сігналам у мікробнай экалогіі, які кантралюе шматлікія функцыі, што ўплываюць на мікробную фізіялогію, утварэнне спор, стабільнасць плазмід, устойлівасць да лекаў, утварэнне біяплёнкі і вірулентнасць 18, 19. Актыўнасць індолу і яго вытворных супраць іншых патагенных нематод не вывучалася. У гэтым даследаванні мы даследавалі нематыцыдную актыўнасць 34 індолаў супраць хваёвых нематод і высветлілі механізм дзеяння найбольш магутнага 5-ёдаіндолу з дапамогай мікраскапіі, паскоранай здымкі і малекулярных дакінгавых эксперыментаў, а таксама ацанілі яго таксічны ўплыў на расліны з дапамогай аналізу прарастання насення.
Раней паведамлялася, што высокія канцэнтрацыі (>1,0 мМ) індолу аказваюць нематоцыдны эфект на нематод17. Пасля апрацоўкі B. xylophilus (змешаныя стадыі жыцця) індолам або 33 рознымі вытворнымі індолу ў канцэнтрацыі 1 мМ, смяротнасць B. xylophilus вымяралася шляхам падліку жывых і мёртвых нематод у кантрольнай і апрацаванай групах. Пяць індолаў праявілі значную нематоцыдную актыўнасць; выжывальнасць неапрацаванай кантрольнай групы складала 95 ± 7% праз 24 гадзіны. З 34 правераных індолаў 5-ёдаіндол і 4-фторіндол у канцэнтрацыі 1 мМ выклікалі 100% смяротнасці, тады як 5,6-дыфторіндыга, метыліндол-7-карбаксілат і 7-ёдаіндол выклікалі прыблізна 50% смяротнасці (табліца 1).
Уплыў 5-ёдаіндолу на ўтварэнне вакуоляў і метабалізм хваёвай нематоды. (A) Уплыў авермектыну і 5-ёдаіндолу на дарослых самцоў нематод, (B) яйкі нематоды стадыі L1 і (C) метабалізм B. xylophilus, (i) вакуолі не назіраліся праз 0 гадзін, апрацоўка прывяла да (ii) вакуоляў, (iii) назапашвання некалькіх вакуоляў, (iv) ацёку вакуоляў, (v) зліцця вакуоляў і (vi) утварэння гіганцкіх вакуоляў. Чырвоныя стрэлкі паказваюць ацёк вакуоляў, сінія стрэлкі паказваюць зліццё вакуоляў, а чорныя стрэлкі паказваюць гіганцкія вакуолі. Маштабная лінейка = 50 мкм.
Акрамя таго, у гэтым даследаванні таксама апісаны паслядоўны працэс гібелі, выкліканай метанам, у хваёвых нематод (малюнак 4C). Метанагенная гібель — гэта неапаптатычны тып гібелі клетак, звязаны з назапашваннем прыкметных цытаплазматычных вакуоляў27. Марфалагічныя дэфекты, якія назіраюцца ў хваёвых нематод, відаць, цесна звязаны з механізмам гібелі, выкліканай метанам. Мікраскапічнае даследаванне ў розны час паказала, што гіганцкія вакуолі ўтварыліся пасля 20 гадзін уздзеяння 5-ёдаіндолу (0,1 мМ). Мікраскапічныя вакуолі назіраліся праз 8 гадзін апрацоўкі, а іх колькасць павялічылася праз 12 гадзін. Некалькі буйных вакуоляў назіраліся праз 14 гадзін. Некалькі зліўшыхся вакуоляў былі выразна бачныя праз 12–16 гадзін апрацоўкі, што сведчыць аб тым, што зліццё вакуоляў з'яўляецца асновай механізму метанагеннай смерці. Праз 20 гадзін па ўсім чарвяку было выяўлена некалькі гіганцкіх вакуоляў. Гэтыя назіранні ўяўляюць сабой першае паведамленне пра метуоз у C. elegans.
У чарвякоў, апрацаваных 5-ёдаіндолам, таксама назіралася агрэгацыя і разрыў вакуоляў (мал. 5), пра што сведчыла выгінанне чарвяка і вызваленне вакуолі ў навакольнае асяроддзе. Парушэнне вакуолі таксама назіралася ў мембране шкарлупіны яек, якая звычайна захоўваецца некранутай L2 падчас вылуплення (дадатковы мал. S2). Гэтыя назіранні пацвярджаюць удзел назапашвання вадкасці і асмарэгулятарнай недастатковасці, а таксама зварачальнага пашкоджання клетак (RCI) у працэсе ўтварэння вакуоляў і нагнаення (мал. 5).
Выказваючы гіпотэзу пра ролю ёду ў назіраным утварэнні вакуолей, мы даследавалі нематыцыдную актыўнасць ёдыду натрыю (NaI) і ёдыду калію (KI). Аднак пры канцэнтрацыях (0,1, 0,5 або 1 мМ) яны не ўплывалі ні на выжывальнасць нематод, ні на ўтварэнне вакуолей (дадатковы малюнак S5), хоць 1 мМ KI меў невялікі нематыцыдны эфект. З іншага боку, 7-ёдаіндол (1 або 2 мМ), як і 5-ёдаіндол, выклікаў множныя вакуолі і структурныя дэфармацыі (дадатковы малюнак S6). Два ёдаіндолы прадэманстравалі падобныя фенатыпічныя характарыстыкі ў хваёвых нематод, у той час як NaI і KI гэтага не зрабілі. Цікава, што індол не выклікаў утварэнне вакуолей у B. xylophilus пры правераных канцэнтрацыях (дадзеныя не паказаны). Такім чынам, вынікі пацвердзілі, што комплекс індол-ёд адказвае за вакуалізацыю і метабалізм B. xylophilus.
Сярод індолаў, правераных на нематыцыдную актыўнасць, 5-ёдаіндол меў найвышэйшы індэкс слізгання -5,89 ккал/моль, за ім ішлі 7-ёдаіндол (-4,48 ккал/моль), 4-фторіндол (-4,33) і індол (-4,03) (Малюнак 6). Моцная вадародная сувязь 5-ёдаіндолу з лейцынам 218 стабілізуе яго звязванне, у той час як усе іншыя вытворныя індолу звязваюцца з серынам 260 праз вадародныя сувязі бакавога ланцуга. Сярод іншых мадэляваных ёдаіндолаў, 2-ёдаіндол мае значэнне звязвання -5,248 ккал/моль, што абумоўлена яго асноўнай вадароднай сувяззю з лейцынам 218. Іншыя вядомыя звязванні ўключаюць 3-ёдаіндол (-4,3 ккал/моль), 4-ёдаіндол (-4,0 ккал/моль) і 6-фторіндол (-2,6 ккал/моль) (Дадатковы малюнак S8). Большасць галагенаваных індолаў і сам індол, за выключэннем 5-ёдаіндолу і 2-ёдаіндолу, утвараюць сувязь з серынам 260. Той факт, што вадародная сувязь з лейцынам 218 сведчыць аб эфектыўным звязванні рэцэптар-ліганд, як гэта назіралася для івермектыну (Дадатковы малюнак S7), пацвярджае, што 5-ёдаіндол і 2-ёдаіндол, як і івермектын, цесна звязваюцца з актыўным цэнтрам рэцэптара GluCL праз лейцын 218 (Малюнак 6 і Дадатковы малюнак S8). Мы мяркуем, што гэта звязванне неабходна для падтрымання адкрытай поравай структуры комплексу GluCL і што, цесна звязваючыся з актыўным цэнтрам рэцэптара GluCL, 5-ёдаіндол, 2-ёдаіндол, авермектын і івермектын такім чынам падтрымліваюць іённы канал адкрытым і дазваляюць паглынанне вадкасці.
Малекулярны докінг індолу і галагенаванага індолу з GluCL. Арыентацыя звязвання лігандаў (A) індолу, (B) 4-фторіндолу, (C) 7-ёдаіндолу і (D) 5-ёдаіндолу з актыўным цэнтрам GluCL. Бялок прадстаўлены стужкай, а вадародныя сувязі асновы паказаны жоўтымі пункцірнымі лініямі. (A′), (B′), (C′) і (D′) паказваюць узаемадзеянне адпаведных лігандаў з навакольнымі амінакіслотнымі рэшткамі, а вадародныя сувязі бакавых ланцугоў пазначаны ружовымі пункцірнымі стрэлкамі.
Былі праведзены эксперыменты для ацэнкі таксічнага ўздзеяння 5-ёдаіндолу на прарастанне насення капусты і радыскі. 5-ёдаіндол (0,05 або 0,1 мМ) або авермектын (10 мкг/мл) аказалі нязначны ўплыў або зусім не аказалі ўплыву на пачатковае прарастанне і з'яўленне парасткаў (Малюнак 7). Акрамя таго, не было выяўлена істотнай розніцы паміж хуткасцю прарастання неапрацаванага кантролю і насення, апрацаванага 5-ёдаіндолам або авермектынам. Уплыў на падаўжэнне стрыжневага кораня і колькасць утвораных бакавых каранёў быў нязначным, хоць 1 мМ (у 10 разоў больш за яго актыўную канцэнтрацыю) 5-ёдаіндолу некалькі затрымліваў развіццё бакавых каранёў. Гэтыя вынікі паказваюць, што 5-ёдаіндол не з'яўляецца таксічным для раслінных клетак і не перашкаджае працэсам развіцця раслін пры даследаваных канцэнтрацыях.
Уплыў 5-ёдаіндолу на прарастанне насення. Прарастанне, парасткі і бакавое ўкараненне насення B. oleracea і R. raphanistrum на агаравым асяроддзі Мурасіге і Скуга з авермектынам або 5-ёдаіндолам або без іх. Прарастанне фіксавалася праз 3 дні інкубацыі пры тэмпературы 22°C.
У гэтым даследаванні паведамляецца пра некалькі выпадкаў знішчэння нематод індоламі. Важна адзначыць, што гэта першае паведамленне пра тое, як ёдаіндол выклікае метыляванне (працэс, выкліканы назапашваннем дробных вакуоляў, якія паступова зліваюцца ў гіганцкія вакуолі, што ў рэшце рэшт прыводзіць да разрыву мембраны і гібелі) у ігліцы хвоі, прычым ёдаіндол праяўляе значныя нематыцыдныя ўласцівасці, падобныя да ўласцівасцей камерцыйнага нематыцыду авермектыну.
Раней паведамлялася, што індолы выконваюць мноства сігнальных функцый у пракарыёт і эўкарыёт, у тым ліку інгібіраванне/ўтварэнне біяплёнкі, выжыванне бактэрый і патагеннасць 19, 32, 33, 34. Нядаўна патэнцыйныя тэрапеўтычныя эфекты галагенаваных індолаў, індолавых алкалоідаў і паўсінтэтычных вытворных індолу прыцягнулі шырокую даследчыцкую ўвагу 35, 36, 37. Напрыклад, было паказана, што галагенаваныя індолы знішчаюць персістуючыя клеткі Escherichia coli і Staphylococcus aureus 37. Акрамя таго, навуковую цікавасць уяўляе вывучэнне эфектыўнасці галагенаваных індолаў супраць іншых відаў, родаў і царстваў, і гэта даследаванне з'яўляецца крокам да дасягнення гэтай мэты.
Тут мы прапануем механізм смяротнасці, выкліканай 5-ёдаіндолам, у C. elegans, заснаваны на зварачальным пашкоджанні клетак (ЗПК) і метыляванні (малюнкі 4C і 5). Ацёкавыя змены, такія як ацёк і вакуолярная дэгенерацыя, з'яўляюцца паказчыкамі ЗПК і метылявання, якія праяўляюцца ў выглядзе гіганцкіх вакуоляў у цытаплазме48,49. ЗПК перашкаджае выпрацоўцы энергіі, зніжаючы выпрацоўку АТФ, выклікаючы збой АТФазнага помпы або парушаючы клеткавыя мембраны і выклікаючы хуткі прыток Na+, Ca2+ і вады50,51,52. Унутрыцытаплазматычныя вакуолі ўзнікаюць у клетках жывёл у выніку назапашвання вадкасці ў цытаплазме з-за прытоку Ca2+ і вады53. Цікава, што гэты механізм пашкоджання клетак зварачальны, калі пашкоджанне часовае і клеткі пачынаюць выпрацоўваць АТФ на працягу пэўнага перыяду часу, але калі пашкоджанне захоўваецца або пагаршаецца, клеткі гінуць.54 Нашы назіранні паказваюць, што нематоды, апрацаваныя 5-ёдаіндолам, не здольныя аднавіць нармальны біясінтэз пасля ўздзеяння стрэсавых умоў.
Фенатып метылявання, індукаваны 5-ёдаіндолам у B. xylophilus, можа быць звязаны з прысутнасцю ёду і яго малекулярным размеркаваннем, паколькі 7-ёдаіндол аказвае меншы інгібіруючы эфект на B. xylophilus, чым 5-ёдаіндол (табліца 1 і дадатковы малюнак S6). Гэтыя вынікі часткова адпавядаюць даследаванням Малтэйза і інш. (2014), якія паведамілі, што транслакацыя пірыдыльнага азотнага фрагмента ў індоле з пара- ў мета-палажэнне ліквідуе вакуалізацыю, інгібіраванне росту і цытатаксічнасць у клетках U251, што сведчыць аб тым, што ўзаемадзеянне малекулы са спецыфічным актыўным цэнтрам у бялку мае вырашальнае значэнне27,44,45. Узаемадзеянне паміж індолам або галагенаванымі індоламі і рэцэптарамі GluCL, якое назіралася ў гэтым даследаванні, таксама пацвярджае гэтую думку, паколькі было выяўлена, што 5- і 2-ёдаіндол звязваюцца з рэцэптарамі GluCL мацней, чым іншыя даследаваныя індолы (малюнак 6 і дадатковы малюнак S8). Было выяўлена, што ёд у другой ці пятай пазіцыі індолу звязваецца з лейцынам 218 рэцэптара GluCL праз вадародныя сувязі ў аснове, у той час як іншыя галагенаваныя індолы і сам індол утвараюць слабыя вадародныя сувязі ў бакавым ланцугу з серынам 260 (малюнак 6). Такім чынам, мы мяркуем, што лакалізацыя галагену адыгрывае важную ролю ў індукцыі вакуолярнай дэгенерацыі, тады як моцнае звязванне 5-ёдаіндолу падтрымлівае іённы канал адкрытым, тым самым дазваляючы хуткаму прытоку вадкасці і разрыву вакуолі. Аднак падрабязны механізм дзеяння 5-ёдаіндолу яшчэ трэба вызначыць.
Перад практычным ужываннем 5-ёдаіндолу неабходна прааналізаваць яго таксічны ўплыў на расліны. Нашы эксперыменты па прарастанні насення паказалі, што 5-ёдаіндол не аказвае негатыўнага ўплыву на прарастанне насення або наступныя працэсы развіцця пры вывучаных канцэнтрацыях (малюнак 7). Такім чынам, гэта даследаванне забяспечвае аснову для выкарыстання 5-ёдаіндолу ў экалагічным асяроддзі для кантролю шкоднаснасці хваёвых нематод для хвойных дрэў.
Папярэднія даследаванні паказалі, што тэрапія на аснове індолу ўяўляе сабой патэнцыйны падыход да вырашэння праблемы ўстойлівасці да антыбіётыкаў і прагрэсавання раку55. Акрамя таго, індолы валодаюць антыбактэрыйнай, супрацьракавай, антіоксідантнай, супрацьзапаленчай, супрацьдыябетычнай, антывіруснай, антыпраліфератыўнай і супрацьтуберкулёзнай актыўнасцю і могуць служыць перспектыўнай асновай для распрацоўкі лекаў56,57. Гэта даследаванне ўпершыню прапануе патэнцыйнае выкарыстанне ёду ў якасці супрацьпаразітарнага і супрацьгліставога сродку.
Авермектын быў адкрыты тры дзесяцігоддзі таму і атрымаў Нобелеўскую прэмію ў 2015 годзе, і яго выкарыстанне ў якасці антыгельмінтнага сродку працягваецца да гэтага часу. Аднак з-за хуткага развіцця ўстойлівасці да авермектынаў у нематод і насякомых-шкоднікаў неабходная альтэрнатыўная, недарагая і экалагічна чыстая стратэгія барацьбы з інфекцыяй PWN у хвоі. У гэтым даследаванні таксама паведамляецца пра механізм, з дапамогай якога 5-ёдаіндол знішчае хваёвых нематод, і пра тое, што 5-ёдаіндол мае нізкую таксічнасць для раслінных клетак, што адкрывае добрыя перспектывы для яго будучага камерцыйнага прымянення.
Усе эксперыменты былі ўхвалены Этычным камітэтам Універсітэта Ённам, Кёнсан, Карэя, і метады былі выкананы ў адпаведнасці з рэкамендацыямі Этычнага камітэта Універсітэта Ённам.
Эксперыменты па інкубацыі яек праводзіліся з выкарыстаннем устаноўленых працэдур43. Для ацэнкі хуткасці вылуплення (HR) аднадзённыя дарослыя нематоды (прыблізна 100 самак і 100 самцоў) пераносілі ў чашкі Петры з грыбком і давалі ім расці на працягу 24 гадзін. Затым яйкі вылучалі і апрацоўвалі 5-ёдаіндолам (0,05 мМ і 0,1 мМ) або авермектынам (10 мкг/мл) у выглядзе суспензіі ў стэрыльнай дыстыляванай вадзе. Гэтыя суспензіі (500 мкл; прыблізна 100 яек) пераносілі ў лункі 24-лункавага пласціны для культуры тканін і інкубавалі пры тэмпературы 22 °C. Падлік L2 праводзілі пасля 24 гадзін інкубацыі, але лічылі мёртвымі, калі клеткі не рухаліся пры стымуляцыі тонкім плацінавым дротам. Гэты эксперымент праводзіўся ў два этапы, кожны з шасцю паўторамі. Дадзеныя з абодвух эксперыментаў былі аб'яднаны і прадстаўлены. Працэнт HR разлічваецца наступным чынам:
Смяротнасць лічынак ацэньвалася з выкарыстаннем раней распрацаваных працэдур. Яйкі нематод збіралі, а эмбрыёны сінхранізавалі шляхам вылуплення ў стэрыльнай дыстыляванай вадзе для атрымання лічынак стадыі L2. Сінхранізаваных лічынак (прыблізна 500 нематод) апрацоўвалі 5-ёдаіндолам (0,05 мМ і 0,1 мМ) або авермектынам (10 мкг/мл) і вырошчвалі на чашках Петры з B. cinerea. Пасля 48 гадзін інкубацыі пры тэмпературы 22 °C нематод збіралі ў стэрыльнай дыстыляванай вадзе і даследавалі на наяўнасць стадый L2, L3 і L4. Наяўнасць стадый L3 і L4 сведчыла аб трансфармацыі лічынак, тады як наяўнасць стадыі L2 сведчыла аб адсутнасці трансфармацыі. Здымкі былі атрыманы з дапамогай сістэмы лічбавай візуалізацыі клетак iRiS™. Гэты эксперымент праводзіўся ў два этапы, кожны з шасцю паўторамі. Дадзеныя абодвух эксперыментаў былі аб'яднаны і прадстаўлены.
Таксічнасць 5-ёдаіндолу і авермектыну для насення ацэньвалася з дапамогай тэстаў на прарастанне на агаравых пласцінках Мурасіге і Скуга.62 Насенне B. oleracea і R. raphanistrum спачатку замочвалі ў стэрыльнай дыстыляванай вадзе на адзін дзень, прамывалі 1 мл 100% этанолу, стэрылізавалі 1 мл 50% камерцыйнага адбельвальніка (3% гіпахларыту натрыю) на працягу 15 хвілін і пяць разоў прамывалі 1 мл стэрыльнай вады. Затым стэрылізаванае насенне выціскалі на агаравыя пласцінкі для прарастання, якія змяшчалі 0,86 г/л (0,2X) асяроддзя Мурасіге і Скуга і 0,7% бактэрыялагічнага агару з 5-ёдаіндолу або авермектыну або без іх. Затым пласцінкі інкубавалі пры тэмпературы 22 °C, і здымкі рабілі праз 3 дні інкубацыі. Гэты эксперымент праводзіўся ў два этапы, кожны з якіх меў шэсць паўтораў.
Час публікацыі: 26 лютага 2025 г.