Сасновая нематода - гэта каранцінны міграцыйны эндапаразіт, які, як вядома, наносіць сур'ёзныя эканамічныя страты экасістэмам хваёвых лясоў. У дадзеным даследаванні разглядаецца нематоцидная актыўнасць галагенаваных індолаў супраць хваёвых нематод і механізм іх дзеяння. Нематоцидная актыўнасць 5-ёдаіндола і авермектыну (станоўчы кантроль) супраць хваёвых нематод была падобнай і высокай пры нізкіх канцэнтрацыях (10 мкг/мл). 5-йодоиндол зніжае пладавітасць, рэпрадуктыўную актыўнасць, эмбрыянальную і лічынкавую смяротнасць і апорна-рухальныя паводзіны. Малекулярныя ўзаемадзеяння лігандаў са спецыфічнымі для бесхрыбтовых рэцэптарамі хларыдных каналаў глутамата пацвярджаюць меркаванне, што 5-ёдаіндол, як і авермектын, цесна звязваецца з актыўным цэнтрам рэцэптара. 5-Ёдаіндол таксама выклікаў розныя фенатыпічнае дэфармацыі ў нематод, уключаючы анамальны калапс/усаджванне органа і павышаную вакуалізацыю. Гэтыя вынікі сведчаць аб тым, што вакуолі могуць гуляць пэўную ролю ў гібелі нематод, апасродкаванай метыляваннем. Важна адзначыць, што 5-ёдаіндол не таксічны для абодвух відаў раслін (капусты і рэдзькі). Такім чынам, гэта даследаванне дэманструе, што прымяненне ёдаіндолу ва ўмовах навакольнага асяроддзя можа кантраляваць пашкоджанне хвоі ад завядання.
Хваёвая драўняная нематода (Bursaphelenchus xylophilus) адносіцца да хваёвых драўняных нематод (PWN), мігруючых эндапаразітычных нематод, якія, як вядома, наносяць сур'ёзную экалагічную шкоду экасістэмам хваёвых лясоў1. Хвароба хваёвага завядання (PWD), выкліканая хваёвай драўнянай нематодай, становіцца сур'ёзнай праблемай на некалькіх кантынентах, уключаючы Азію і Еўропу, а ў Паўночнай Амерыцы нематода знішчае інтрадуцыраваныя віды хвоі1,2. Знішчэнне сасны з'яўляецца сур'ёзнай эканамічнай праблемай, і перспектыва яе глабальнага распаўсюджвання выклікае трывогу3. Часцей за ўсё наступныя віды хвоі падвяргаюцца нападам нематод: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii і Pinus radiata4. Хваёвая нематода - сур'ёзнае захворванне, якое можа забіць сасны на працягу некалькіх тыдняў ці месяцаў пасля заражэння. Акрамя таго, успышкі хваёвай нематоды часта сустракаюцца ў розных экасістэмах, таму былі ўстаноўлены ўстойлівыя ланцужкі заражэння1.
Bursaphelenchus xylophilus - каранцінная расліна-паразітычная нематода, якая належыць да надсямейства Aphelenchoidea і клады 102.5. Нематода сілкуецца грыбамі і размнажаецца ў драўняных тканінах хваёвых дрэў, развіваючыся ў чатыры розныя лічынкавыя стадыі: L1, L2, L3, L4 і дарослае асобіна1,6. Ва ўмовах дэфіцыту ежы хваёвая нематода пераходзіць у спецыялізаваную лічынкавую стадыю - дауэр, якая паразітуе на сваім пераносчыку - хваёвым караедзе (Monochamus alternatus) і пераносіцца на здаровыя хваёвыя дрэвы. У здаровых гаспадароў нематоды хутка мігруюць па тканінах раслін і сілкуюцца паренхиматозными клеткамі, што прыводзіць да шэрагу рэакцый гіперчувствітельності, завядання хвоі і гібелі на працягу года пасля заражэння1,7,8.
Біялагічная барацьба з хваёвымі нематодамі ўжо даўно з'яўляецца складанай задачай, каранцінныя меры бяруць пачатак з 20-га стагоддзя. Сучасныя стратэгіі барацьбы з хваёвымі нематодамі ў першую чаргу ўключаюць хімічную апрацоўку, у тым ліку фумігацыю драўніны і ўкараненне нематыцыдаў у ствалы дрэў. Найбольш часта выкарыстоўваюцца нематыцыды - авермектын і авермектын бензаат, якія належаць да сямейства авермектынаў. Гэтыя дарагія хімікаты вельмі эфектыўныя супраць многіх відаў нематод і лічацца экалагічна бяспечнымі9. Аднак чакаецца, што шматразовае выкарыстанне гэтых нематоцыдаў створыць ціск селекцыі, які амаль напэўна прывядзе да з'яўлення ўстойлівых хваёвых нематод, як гэта было прадэманстравана для некалькіх насякомых-шкоднікаў, такіх як Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella і нематод Trichostrongylus colubriformis і Ostertagia circumcincta, якія паступова выпрацавалі ўстойлівасць да авермектины10,11,12. Такім чынам, мадэлі ўстойлівасці неабходна рэгулярна вывучаць і нематоциды бесперапынна правяраць, каб знайсці альтэрнатыўныя, эканамічна эфектыўныя і экалагічна чыстыя меры для кантролю PVD. У апошнія дзесяцігоддзі шэраг аўтараў прапанавалі выкарыстоўваць раслінныя экстракты, эфірныя алею і фітонціды ў якасці сродкаў барацьбы з нематодамі13,14,15,16.
Нядаўна мы прадэманстравалі нематыцыдную актыўнасць індолу, міжклеткавай і міжцарэўнай сігнальнай малекулы, у Caenorhabditis elegans 17 . Індол з'яўляецца шырока распаўсюджаным ўнутрыклеткавым сігналам у мікробнай экалогіі, які кантралюе шматлікія функцыі, якія ўплываюць на фізіялогію мікробаў, адукацыю спрэчка, стабільнасць плазміды, устойлівасць да лекаў, адукацыю біяплёнкі і вірулентнасць 18, 19. Актыўнасць індол і яго вытворных супраць іншых патагенных нематод не вывучана. У гэтым даследаванні мы даследавалі нематыцыдную актыўнасць 34 індолаў супраць хваёвых нематод і высветлілі механізм дзеяння найбольш моцнадзейнага 5-ёдаіндолу з выкарыстаннем мікраскапіі, пакадравай фатаграфіі і малекулярных докінг-эксперыментаў, а таксама ацанілі яго таксічнае ўздзеянне на расліны з дапамогай аналізу прарастання насення.
Раней паведамлялася, што высокія канцэнтрацыі (>1,0 ммоль) індолу аказваюць нематоцыдны эфект на нематод17. Пасля апрацоўкі B. xylophilus (змешаныя стадыі жыцця) індолам або 33 рознымі вытворнымі індолу ў колькасці 1 мМ смяротнасць B. xylophilus вымяралася шляхам падліку жывых і мёртвых нематод у кантрольнай і апрацаванай групах. Пяць індол праявілі значную нематоцидную актыўнасць; выжывальнасць нелеченной кантрольнай групы склала 95 ± 7% праз 24 гадзіны. З 34 правераных індолаў 5-ёдаіндол і 4-фтораіндол пры 1 мМ выклікалі 100% смяротнасць, у той час як 5,6-дыфтараіндыга, метилиндол-7-карбаксілат і 7-ёдаіндол выклікалі прыкладна 50% смяротнасць (табліца 1).
Уплыў 5-йодоиндола на адукацыю вакуоляў і метабалізм хваёвай драўнянай нематоды. (A) Уплыў авермектыну і 5-ёдаіндолу на дарослых самцоў нематод, (B) яйкі нематод стадыі L1 і (C) метабалізм B. xylophilus, (i) вакуолі не назіраліся праз 0 гадзін, лячэнне прывяло да (ii) вакуоляў, (iii) назапашвання некалькіх вакуоляў, (iv) набракання вакуоляў, (v) зліццё вакуоляў і (vi) утварэнне гіганцкіх вакуоляў. Чырвоныя стрэлкі паказваюць на набраканне вакуоляў, сінія - зліццё вакуоляў, а чорныя - гіганцкія вакуолі. Шкала = 50 мкм.
Акрамя таго, гэта даследаванне таксама апісвае паслядоўны працэс гібелі хваёвых нематод, выкліканай метанам (малюнак 4C). Метанагенная гібель - гэта неапоптозный тып гібелі клетак, звязаны з назапашваннем прыкметных цытаплазматычных вакуоляў27. Марфалагічныя дэфекты, якія назіраюцца ў хваёвых нематод, па-відаць, цесна звязаны з механізмам гібелі, выкліканай метанам. Мікраскапічнае даследаванне ў розны час паказала, што пасля 20-гадзіннага ўздзеяння 5-йодоиндола (0,1 мМ) утвараюцца гіганцкія вакуолі. Мікраскапічныя вакуолі назіраліся праз 8 ч пасля апрацоўкі, а іх колькасць павялічвалася праз 12 ч. Некалькі буйных вакуоляў назіраліся праз 14 гадзін. Некалькі злітых вакуоляў былі выразна бачныя пасля 12-16 гадзін лячэння, што сведчыць аб тым, што зліццё вакуоляў з'яўляецца асновай механізму метанагеннай смерці. Праз 20 гадзін ва ўсім чарвяку было знойдзена некалькі гіганцкіх вакуоляў. Гэтыя назіранні ўяўляюць сабой першае паведамленне аб метуозе ў C. elegans.
У чарвякоў, апрацаваных 5-ёдаіндолам, таксама назіралася агрэгацыя і разрыў вакуолі (мал. 5), пра што сведчыць выгіб чарвяка і выхад вакуолі ў навакольнае асяроддзе. Разбурэнне вакуолі таксама назіралася ў мембране яечнай шкарлупіны, якая звычайна захоўваецца непашкоджанай L2 падчас вылуплення (дадатковы малюнак S2). Гэтыя назіранні пацвярджаюць удзел назапашвання вадкасці і недастатковасці осморегуляции, а таксама зварачальнага пашкоджання клетак (RCI), у працэсе адукацыі вакуолі і нагнаення (мал. 5).
Выказваючы гіпотэзу аб ролі ёду ў назіраным адукацыі вакуолі, мы даследавалі нематоцидную актыўнасць ёдыду натрыю (NaI) і ёдыду калію (KI). Аднак у канцэнтрацыях (0,1, 0,5 або 1 ммоль) яны не ўплывалі ні на выжыванне нематод, ні на адукацыю вакуоляў (дадатковы мал. S5), хоць 1 ммоль KI аказваў невялікі нематоцыдны эфект. З іншага боку, 7-ёдаіндол (1 або 2 мМ), як і 5-ёдаіндол, выклікаў мноства вакуоляў і структурныя дэфармацыі (дадатковы мал. S6). Два ёдаіндолы паказалі падобныя фенатыпічныя характарыстыкі ў хваёвых нематод, у той час як NaI і KI гэтага не зрабілі. Цікава, што індол не выклікаў адукацыю вакуоляў у B. xylophilus пры выпрабаваных канцэнтрацыях (дадзеныя не паказаны). Такім чынам, вынікі пацвердзілі, што комплекс індол-ёд адказвае за вакуолизацию і метабалізм B. xylophilus.
Сярод індолаў, пратэставаных на нематыцыдную актыўнасць, 5-ёдаіндол меў самы высокі індэкс слізгацення -5,89 ккал/моль, за ім ішлі 7-ёдаіндол (-4,48 ккал/моль), 4-фтораіндол (-4,33) і індол (-4,03) (малюнак 6). Моцная асноўная вадародная сувязь 5-ёдаіндолу з лейцынам 218 стабілізуе яго звязванне, у той час як усе іншыя вытворныя індолу звязваюцца з серынам 260 праз вадародныя сувязі бакавога ланцуга. Сярод іншых мадэляваных ёдаіндолаў 2-ёдаіндол мае значэнне звязвання -5,248 ккал/моль, што звязана з яго асноўнай вадароднай сувяззю з лейцынам 218. Іншыя вядомыя звязванні ўключаюць 3-ёдаіндол (-4,3 ккал/моль), 4-ёдаіндол (-4,0 ккал/моль) і 6-фтораіндол (-2,6). ккал/моль) (дадатковы малюнак S8). Большасць галагенаваных індолаў і сам індол, за выключэннем 5-ёдаіндола і 2-ёдаіндолу, утвараюць сувязь з серынам 260. Той факт, што вадародная сувязь з лейцынам 218 сведчыць аб эфектыўным звязванні рэцэптараў з лігандам, як назіраецца для івермектыну (дадатковы малюнак S7), пацвярджае, што 5-ёдаіндол і 2-ёдаіндол, як івермектын, цесна звязваецца з актыўным цэнтрам рэцэптара GluCL праз лейцын 218 (мал. 6 і дадатковы малюнак S8). Мы мяркуем, што гэта звязванне неабходна для падтрымання структуры адкрытых пор комплексу GluCL і што, цесна звязваючыся з актыўным цэнтрам рэцэптара GluCL, 5-ёдаіндол, 2-ёдаіндол, авермектын і івермектын такім чынам падтрымліваюць адкрыты іённы канал і дазваляюць паглынанне вадкасці.
Малекулярная стыкоўка індолу і галагеніраванага індолу да GluCL. Арыентацыі звязвання (A) індола, (B) 4-фтораіндолу, (C) 7-іадаіндолу і (D) 5-іадаіндолу лігандаў да актыўнага цэнтра GluCL. Бялок прадстаўлены стужкай, а асноўныя вадародныя сувязі паказаны жоўтымі пункцірнымі лініямі. (A'), (B'), (C') і (D') паказваюць узаемадзеянне адпаведных лігандаў з навакольнымі амінакіслотнымі рэшткамі, а вадародныя сувязі бакавой ланцуга пазначаны ружовымі пункцірнымі стрэлкамі.
Праведзены вопыты па ацэнцы таксічнага дзеяння 5-йодоиндола на ўсходжасць насення капусты і радыскі. 5-ёдаіндол (0,05 або 0,1 ммоль) або авермектын (10 мкг/мл) практычна не ўплывалі на пачатковае прарастанне і з'яўленне раслін (малюнак 7). Акрамя таго, істотнай розніцы не было выяўлена паміж хуткасцю ўсходжасці неапрацаваных кантрольных культур і насення, апрацаваных 5-ёдаіндолам або авермектынам. Ўплыў на падаўжэнне стрыжневага кораня і колькасць якія ўтвараюцца бакавых каранёў было нязначным, хоць 1 мМ (у 10 разоў больш актыўнай канцэнтрацыі) 5-йодоиндола нязначна затрымліваў развіццё бакавых каранёў. Гэтыя вынікі паказваюць, што 5-ёдаіндол не таксічны для раслінных клетак і не перашкаджае працэсам развіцця раслін пры даследаваных канцэнтрацыях.
Ўплыў 5-йодоиндола на прарастанне насення. Прарошчванне, прарастанне і бакавое ўкараненне насення B. oleracea і R. raphanistrum на агаровым асяроддзі Мурасіге і Скуга з або без авермектыну або 5-ёдаіндолу. Ўсходжасць была зарэгістраваная праз 3 дні інкубацыі пры 22°C.
Гэта даследаванне паведамляе пра некалькі выпадкаў знішчэння нематод індоламі. Важна адзначыць, што гэта першае паведамленне аб метилировании, якое выклікае ёдаіндол (працэс, выкліканы назапашваннем невялікіх вакуоляў, якія паступова зліваюцца ў гіганцкія вакуолі, што ў канчатковым выніку прыводзіць да разрыву мембраны і гібелі) у хваёвых ігліцах, прычым ёдаіндол праяўляе значныя нематыцыдныя ўласцівасці, падобныя на ўласцівасці камерцыйнага нематыцыду авермектыну.
Раней паведамлялася, што індалі выконваюць некалькі сігнальных функцый у пракарыёт і эукарыёт, уключаючы інгібіраванне/фарміраванне біяплёнкі, выжыванне бактэрый і патагеннасць19,32,33,34. У апошні час патэнцыяльныя тэрапеўтычныя эфекты галагенаваных індолаў, індол-алкалоідаў і паўсінтэтычных вытворных індолу прыцягнулі да сябе вялікую цікавасць даследнікаў35,36,37. Напрыклад, было паказана, што галагенаваныя індалі знішчаюць клеткі кішачнай палачкі і залацістага стафілакока [37]. Акрамя таго, навуковая цікавасць уяўляе вывучэнне эфектыўнасці галогенсодержащих індолаў супраць іншых відаў, родаў і каралеўстваў, і гэта даследаванне з'яўляецца крокам да дасягнення гэтай мэты.
Тут мы прапануем механізм 5-ёдаіндол-індукаванай смяротнасці ў C. elegans, заснаваны на зварачальным пашкоджанні клетак (RCI) і метилировании (малюнкі 4C і 5). Ацёкавыя змены, такія як азызласць і вакуолярная дэгенерацыя, з'яўляюцца паказчыкамі RCI і метылявання, якія выяўляюцца ў выглядзе гіганцкіх вакуоляў у цытаплазме48,49. RCI перашкаджае выпрацоўцы энергіі, зніжаючы выпрацоўку АТФ, выклікаючы збой АТФ-азнага помпы або разбураючы клеткавыя мембраны і выклікаючы хуткі прыток Na+, Ca2+ і вады 50,51,52. Унутрыцытаплазматычныя вакуолі ўзнікаюць у клетках жывёл у выніку назапашвання вадкасці ў цытаплазме за кошт прытоку Са2+ і вады53. Цікава, што гэты механізм пашкоджання клетак зварачальны, калі пашкоджанне часовае і клеткі пачынаюць выпрацоўваць АТФ на працягу пэўнага перыяду часу, але калі пашкоджанне захоўваецца або пагаршаецца, клеткі гінуць.54 Нашы назіранні паказваюць, што нематоды, апрацаваныя 5-ёдаіндолам, не здольныя аднавіць нармальны біясінтэз пасля ўздзеяння стрэсавых умоў.
Фенатып метылявання, індукаваны 5-ёдаіндолам у B. xylophilus, можа быць абумоўлены прысутнасцю ёду і яго малекулярным размеркаваннем, паколькі 7-ёдаіндол аказаў меншы інгібіруючы эфект на B. xylophilus, чым 5-ёдаіндол (табліца 1 і дадатковы малюнак S6). Гэтыя вынікі часткова супадаюць з даследаваннямі Maltese et al. (2014), якія паведамілі, што перамяшчэнне фрагмента пірыдыльнага азоту ў індоле з пара- ў мета-становішча ліквідавала вакуалізацыю, інгібіраванне росту і цытатаксічнасць у клетках U251, мяркуючы, што ўзаемадзеянне малекулы са спецыфічным актыўным цэнтрам у бялку мае вырашальнае значэнне27,44,45. Узаемадзеянне паміж індолам або галагенаванымі індоламі і рэцэптарамі GluCL, назіранае ў гэтым даследаванні, таксама пацвярджае гэта меркаванне, паколькі было выяўлена, што 5- і 2-ёдаіндол звязваюцца з рэцэптарамі GluCL мацней, чым іншыя даследаваныя індолы (малюнак 6 і дадатковы малюнак S8). Было выяўлена, што ёд у другім або пятым становішчы індолу звязваецца з лейцынам 218 рэцэптара GluCL праз магістральныя вадародныя сувязі, у той час як іншыя галагенаваныя індолу і сам індол утвараюць слабыя вадародныя сувязі бакавой ланцуга з серынам 260 (малюнак 6). Таму мы мяркуем, што лакалізацыя галагена гуляе важную ролю ў індукцыі вакуолярной дэгенерацыі, у той час як цеснае звязванне 5-йодоиндола трымае іённы канал адкрытым, тым самым забяспечваючы хуткі прыток вадкасці і разрыў вакуолі. Аднак падрабязны механізм дзеяння 5-йодоиндола яшчэ трэба будзе высветліць.
Перад практычным прымяненнем 5-йодоиндола неабходна прааналізаваць яго таксічнае дзеянне на расліны. Нашы эксперыменты па прарошчванні насення паказалі, што 5-ёдаіндол не аказваў негатыўнага ўплыву на прарастанне насення або наступныя працэсы развіцця пры даследаваных канцэнтрацыях (малюнак 7). Такім чынам, гэта даследаванне дае аснову для выкарыстання 5-ёдаіндола ў экалагічнай асяроддзі для кантролю над шкоднасцю хваёвых нематод для хваёвых дрэў.
Папярэднія справаздачы паказалі, што тэрапія на аснове індолу ўяўляе сабой патэнцыйны падыход да вырашэння праблемы ўстойлівасці да антыбіётыкаў і прагрэсавання рака55. Акрамя таго, індол валодае антыбактэрыйным, супрацьракавым, антіоксідантным, супрацьзапаленчым, антидиабетическим, супрацьвірусным, антипролиферативным і процітуберкулёзным дзеяннем і можа служыць перспектыўнай асновай для распрацоўкі лекаў56,57. Гэта даследаванне ўпершыню сведчыць пра патэнцыйнае выкарыстанне ёду ў якасці супрацьпаразітарнага і глістагоннага сродкі.
Авермектын быў адкрыты тры дзесяцігоддзі таму і атрымаў Нобелеўскую прэмію ў 2015 годзе, і яго выкарыстанне ў якасці глістагоннага сродкі ўсё яшчэ актыўна працягваецца. Аднак у сувязі з хуткім развіццём устойлівасці да авермектынаў у нематод і насякомых-шкоднікаў неабходная альтэрнатыўная, недарагая і экалагічна чыстая стратэгія барацьбы з заражэннем хваёвым ядром. У гэтым даследаванні таксама паведамляецца пра механізм, з дапамогай якога 5-ёдаіндол знішчае хваёвых нематод і што 5-ёдаіндол мае нізкую таксічнасць для раслінных клетак, што адкрывае добрыя перспектывы для яго будучага камерцыйнага прымянення.
Усе эксперыменты былі адобраны Камітэтам па этыцы Універсітэта Ённам, Кёнсан, Карэя, і метады праводзіліся ў адпаведнасці з рэкамендацыямі Камітэта па этыцы Універсітэта Ённам.
Эксперыменты па інкубацыі яек праводзіліся з выкарыстаннем устаноўленых працэдур43. Каб ацаніць хуткасць вылуплення (HR), 1-дзённыя дарослыя нематоды (прыблізна 100 самак і 100 самцоў) былі перанесены ў чашкі Петры, якія змяшчаюць грыб, і далі расці на працягу 24 гадзін. Затым яйкі вылучалі і апрацоўвалі 5-ёдаіндолам (0,05 ммоль і 0,1 ммоль) або авермектынам (10 мкг/мл) у выглядзе завісі ў стэрыльнай дыстыляванай вадзе. Гэтыя завісі (500 мкл; прыблізна 100 яек) пераносілі ў лункі 24-лункавага пласціны для культуры тканін і инкубировали пры 22 °C. Падлік L2 быў зроблены пасля 24 гадзін інкубацыі, але лічыўся мёртвым, калі клеткі не рухаліся пры стымуляцыі тонкай плацінавай дротам. Гэты эксперымент праводзіўся ў два этапы, кожны з шасці паўтораў. Дадзеныя абодвух эксперыментаў былі аб'яднаны і прадстаўлены. Працэнт HR разлічваецца наступным чынам:
Смяротнасць лічынак ацэньвалі з дапамогай раней распрацаваных працэдур. Яйкі нематод збіралі, а эмбрыёны сінхранізавалі шляхам вылуплення ў стэрыльнай дыстыляванай вадзе для стварэння лічынак стадыі L2. Сінхранізаваныя лічынкі (прыкладна 500 нематод) апрацоўвалі 5-ёдаіндолам (0,05 мМ і 0,1 мМ) або авермектынам (10 мкг/мл) і вырошчвалі на пласцінах Петры B. cinerea. Пасля 48 гадзін інкубацыі пры 22 °C нематоды збіралі ў стэрыльную дыстыляваную ваду і даследавалі на наяўнасць стадый L2, L3 і L4. Наяўнасць стадый L3 і L4 паказвае на трансфармацыю лічынкі, у той час як наяўнасць стадыі L2 паказвае на адсутнасць трансфармацыі. Выявы былі атрыманы з дапамогай iRiS™ Digital Cell Imaging System. Гэты эксперымент праводзіўся ў два этапы, кожны з шасці паўтораў. Дадзеныя абодвух эксперыментаў былі аб'яднаны і прадстаўлены.
Таксічнасць 5-ёдаіндолу і авермектыну для насення ацэньвалі з дапамогай тэстаў на прарастанне на пласцінах з агарам Мурасіге і Скуга.62 Насенне B. oleracea і R. raphanistrum спачатку замочвалі ў стэрыльнай дыстыляванай вадзе на адзін дзень, прамывалі 1 мл 100% этанолу, стэрылізавалі 1 мл 50% камерцыйнага адбельвальніка (3% гипохлорита натрыю) на працягу 15 хвілін і промывают пяць разоў 1 мл стэрыльнай вады. Затым стэрылізаваныя насенне націскалі на пласціны з агарам для прарошчвання, якія змяшчалі 0,86 г/л (0,2Х) асяроддзя Мурасіге і Скуга і 0,7% бактэрыялагічны агар з 5-ёдаіндолам або авермектынам або без іх. Затым пласціны інкубавалі пры 22 °C, а выявы рабілі праз 3 дні інкубацыі. Гэты эксперымент праводзіўся ў два этапы, кожны з якіх меў шэсць паўтораў.
Час публікацыі: 26 лютага 2025 г