Дзякуй за наведванне сайта Nature.com. Версія браўзера, якой вы карыстаецеся, мае абмежаваную падтрымку CSS. Для дасягнення найлепшых вынікаў рэкамендуем выкарыстоўваць больш новую версію браўзера (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer). Тым часам, каб забяспечыць пастаянную падтрымку, мы паказваем сайт без стыляў і JavaScript.
Адкрыццё і карыснае выкарыстанне натуральных прадуктаў можа дапамагчы палепшыць жыццё чалавека. Хімічныя рэчывы, якія інгібіруюць рост раслін, шырока выкарыстоўваюцца ў якасці гербіцыдаў для барацьбы з пустазеллем. З-за неабходнасці выкарыстання розных тыпаў гербіцыдаў існуе неабходнасць ідэнтыфікацыі злучэнняў з новымі механізмамі дзеяння. У гэтым даследаванні мы выявілі новае N-алкоксіпірольнае злучэнне, кумамонамід, з Streptomyces werraensis MK493-CF1 і ўстанавілі поўны працэс сінтэзу. З дапамогай аналізаў біялагічнай актыўнасці мы выявілі, што урс-монаамінавая кіслата з'яўляецца сінтэтычным прамежкавым прадуктам урс-монааміду і патэнцыйным...інгібітар росту раслінАкрамя таго, мы распрацавалі розныя вытворныя урбенонавай кіслаты, у тым ліку урбенілаксівытворнае (УДА), якое валодае высокай гербіцыднай актыўнасцю, не аказваючы негатыўнага ўплыву на рост клетак HeLa. Мы таксама выявілі, што вытворныя урматанавай кіслаты парушаюць мікратрубачкі раслін; акрамя таго, KAND уплывае на актынавыя філаменты і выклікае гібель клетак; гэтыя шматгранныя эфекты адрозніваюцца ад эфектаў вядомых інгібітараў мікратрубачак і сведчаць аб новым механізме дзеяння урсонавай кіслаты, што з'яўляецца важнай перавагай у распрацоўцы новых гербіцыдаў.
Адкрыццё і практычнае прымяненне карысных прыродных прадуктаў і іх вытворных з'яўляецца сродкам паляпшэння якасці жыцця чалавека. Другасныя метабаліты, якія выпрацоўваюцца мікраарганізмамі, раслінамі і насякомымі, прывялі да значных поспехаў у медыцыне і сельскай гаспадарцы. Шматлікія антыбіётыкі і супрацьлейкемічныя прэпараты былі распрацаваны з прыродных прадуктаў. Акрамя таго, розныя відыпестыцыдыЗ гэтых прыродных прадуктаў здабываюць фунгіцыды і гербіцыды для выкарыстання ў сельскай гаспадарцы. У прыватнасці, гербіцыды для барацьбы з пустазеллем з'яўляюцца важнымі інструментамі для павышэння ўраджайнасці сельскагаспадарчых культур у сучаснай сельскай гаспадарцы, і розныя тыпы злучэнняў ужо выкарыстоўваюцца ў камерцыйных мэтах. Тыповымі мішэнямі гербіцыдаў лічацца некалькі клетачных працэсаў у раслінах, такія як фотасінтэз, метабалізм амінакіслот, сінтэз клеткавай сценкі, рэгуляцыя мітозу, сігналізацыя фітагармонаў або сінтэз бялку. Злучэнні, якія інгібіруюць функцыю мікратрубачак, з'яўляюцца распаўсюджаным класам гербіцыдаў, якія ўплываюць на рост раслін, уплываючы на мітатычную рэгуляцыю2.
Мікратрубачкі з'яўляюцца кампанентамі цыташкілета і шырока кансерватыўныя ў эўкарыятычных клетках. Гетэрадымер тубуліну складаецца з α-тубуліну і β-тубуліну, якія ўтвараюць лінейныя пратафіламенты мікратрубачак, прычым 13 пратафіламентаў утвараюць цыліндрычную структуру. Мікратрубачкі гуляюць мноства роляў у раслінных клетках, у тым ліку вызначаюць форму клеткі, дзяленне клетак і ўнутрыклетачны транспарт3,4. Раслінныя клеткі ўтрымліваюць мікратрубачкі пад міжфазнай плазматычнай мембранай, і гэтыя так званыя коркавыя мікратрубачкі, як мяркуюць, кантралююць арганізацыю цэлюлозных мікрафібрыл праз рэгуляцыю комплексаў цэлюлозна-сінтазных комплексаў4,5. Коркавыя мікратрубачкі эпідэрмальных клетак кораня, якія прысутнічаюць у зоне хуткага падаўжэння кончыка кораня, размешчаны латэральна, а цэлюлозныя мікравалакна ідуць за гэтымі мікратрубачкамі і абмяжоўваюць кірунак пашырэння клетак, тым самым спрыяючы анізатропнаму падаўжэнню клетак. Такім чынам, функцыя мікратрубачак цесна звязана з марфалогіяй раслін. Замены амінакіслот у генах, якія кадуюць тубулін, выклікаюць перакос масіваў коркавых мікратрубачак і рост злева або справа ў Arabidopsis6,7. Падобным чынам, мутацыі ў бялках, звязаных з мікратрубачкамі, якія рэгулююць дынаміку мікратрубачак, таксама могуць прывесці да скажэння росту каранёў8,9,10,11,12,13. Акрамя таго, апрацоўка гербіцыдамі, якія парушаюць мікратрубачкі, такімі як дызапірамід, таксама вядомы як прэтылахлор, таксама выклікае левабаковы касы рост каранёў14. Гэтыя дадзеныя паказваюць, што дакладная рэгуляцыя функцыі мікратрубачак мае вырашальнае значэнне для вызначэння кірунку росту раслін.
Былі адкрыты розныя тыпы інгібітараў мікратрубачак, і гэтыя прэпараты зрабілі значны ўнёсак у даследаванні цыташкілета, а таксама ў сельскую гаспадарку і медыцыну2. У прыватнасці, арызалін, дынітраанілінавыя злучэнні, дызапірамід, злучэнні, роднасныя бензаміду, і іх аналагі могуць інгібіраваць функцыю мікратрубачак і тым самым перашкаджаць росту раслін. Таму яны шырока выкарыстоўваюцца ў якасці гербіцыдаў. Аднак, паколькі мікратрубачкі з'яўляюцца важным кампанентам раслінных і жывёльных клетак, большасць інгібітараў мікратрубачак з'яўляюцца цытатаксічнымі для абодвух тыпаў клетак. Таму, нягледзячы на іх прызнаную карыснасць у якасці гербіцыдаў, для практычных мэтаў выкарыстоўваецца абмежаваная колькасць антымікратрубачачных агентаў.
Streptomyces — гэта род сямейства Streptomyces, які ўключае аэробныя, грамстаноўчыя, ніткападобныя бактэрыі і шырока вядомы сваёй здольнасцю выпрацоўваць шырокі спектр другасных метабалітаў. Таму ён лічыцца адной з найважнейшых крыніц новых біялагічна актыўных прыродных прадуктаў. У дадзеным даследаванні мы выявілі новае злучэнне пад назвай кумамонамід, якое было выдзелена з Streptomyces werraensis MK493-CF1 і S. werraensis ISP 5486. З дапамогай спектральнага аналізу і поўнага спектральнага аналізу была ахарактарызавана структура кумамонаміду і вызначаны яго ўнікальны N-алкоксіпірольны шкілет. Было выяўлена, што ўрсмонавая кіслата, сінтэтычны прамежкавы прадукт урсмонааміду і яго вытворных, інгібіруе рост і прарастанне папулярнай мадэльнай расліны Arabidopsis thaliana. У даследаванні суадносін структуры і актыўнасці мы выявілі, што злучэнне з C9, мадыфікаваным у урсонавай кіслаце, якое называецца нонілаксівытворным урсонавай кіслаты (KAND), значна ўзмацняе інгібіруючы эфект на рост і прарастанне. Характэрна, што нядаўна адкрыты інгібітар росту раслін таксама ўплываў на рост тытуню і пячоначніка і не быў цытатаксічным для бактэрый або клетак HeLa. Больш за тое, некаторыя вытворныя урматонавай кіслаты выклікаюць скажэнне фенатыпу кораня, што сведчыць аб тым, што гэтыя вытворныя непасрэдна або ўскосна ўплываюць на мікратрубачкі. У адпаведнасці з гэтай ідэяй, нашы назіранні за мікратрубачкамі, мечанымі імунагістахімічна або флуарэсцэнтнымі бялкамі, паказваюць, што апрацоўка KAND дэпалімерызуе мікратрубачкі. Акрамя таго, апрацоўка вытворнымі кумаматонавай кіслаты парушала актынавыя мікрафіламенты. Такім чынам, мы адкрылі новы інгібітар росту раслін, унікальны механізм дзеяння якога заключаецца ў разбурэнні цыташкілета.
Штам MK493-CF1 быў выдзелены з глебы ў Сінагава-ку, Токіо. Штам MK493-CF1 утварыў добра разгалінаваны стромальны міцэлій. Была вызначана частковая паслядоўнасць гена 16S рыбасомнай РНК (1422 пар асноў). Гэты штам вельмі падобны да S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 пар асноў, T: тыповы штам, 99,93%). На падставе гэтага выніку было ўстаноўлена, што гэты штам цесна звязаны з тыповым штамам S. werraensis. Таму мы папярэдне назвалі гэты штам S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T таксама выпрацоўвае тыя ж біялагічна актыўныя злучэнні. Паколькі ранніх даследаванняў па атрыманні натуральных прадуктаў з гэтага мікраарганізма было мала, былі праведзены далейшыя хімічныя даследаванні. Пасля культывавання S. werraensis MK493-CF1 на ячменным асяроддзі метадам цвёрдафазнай ферментацыі пры тэмпературы 30°C на працягу 14 дзён, асяроддзе экстрагавалі 50% этанолам. 60 мл узору высушылі, атрымаўшы 59,5 мг неачышчанага экстракта. Неачышчаны экстракт падвергнулі ВЭЖХ з адваротнай фазай, атрымаўшы N-метаксі-1H-пірол-2-карбаксамід (1, названы кумамонамідам, 36,0 мг). Агульная колькасць 1 складае прыблізна 60% ад неачышчанага экстракта. Таму мы вырашылі падрабязна вывучыць уласцівасці кумамотааміду 1.
Кумамонамід 1 — гэта белы аморфны парашок, і мас-спектрометрыя высокага разрознення (HRESIMS) пацвярджае наяўнасць C6H8N2O2 (мал. 1). C2-замешчаны пірольны фрагмент гэтага злучэння характарызуецца δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Гц, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH у спектры ЯМР 1H: 4,5 Гц, H-5) і δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Гц, H-6), а спектр ЯМР 13C паказвае наяўнасць чатырох атамаў вугляроду sp2. Прысутнасць аміднай групы ў становішчы C2 была ацэненая з дапамогай карэляцыі HMBC ад пратона C-3 да карбанільнага вугляроду аміду пры δC 161,1. Акрамя таго, пікі 1H і 13C ЯМР пры δH 4,10 (3H, S) і δC 68,3 сведчаць аб наяўнасці N-метоксігруп у малекуле. Нягледзячы на тое, што правільнае становішча метоксігрупы яшчэ не было вызначана з дапамогай спектраскапічнага аналізу, такога як пашыраная дыферэнцыяльная спектраскапія і ядзерная абрэвіятура Оверхаўзера (NOEDF), першым кандыдатам на ўключэнне ў склад злучэння стаў N-метоксі-1H-пірол-2-карбаксамід.
Каб вызначыць правільную структуру 1, быў праведзены поўны сінтэз (мал. 2a). Апрацоўка камерцыйна даступнага 2-амінапірыдыну 2 з дапамогай m-CPBA прывяла да атрымання адпаведнага N-аксіду 3 з колькасным выхадам. Пасля 2-амінаазідавання 2 рэакцыя цыклакандэнсацыі, апісаная Абрамовічам, была праведзена ў бензоле пры тэмпературы 90°C для атрымання жаданага 1-гідраксі-1H-пірол-2-карбанітрылу 5 у грамах. Хуткасць 60% (дзве стадыі). 15,16. Метыляванне і гідроліз 4 затым далі 1-метаксі-1H-пірол-2-карбонавую кіслату (якую называюць «куматонавай кіслатой», 6) з добрым выхадам (70%, дзве стадыі). Нарэшце, амідаванне праз прамежкавы хларыд кіслаты 6 з выкарыстаннем воднага аміяку дало амід Кумамота 1 з выхадам 98%. Усе спектральныя дадзеныя сінтэзаванага 1 былі падобныя да выдзеленага 1, таму структура 1 была вызначана;
Агульны сінтэз і аналіз біялагічнай актыўнасці ўрбенаміду і ўрбенавай кіслаты. (а) Поўны сінтэз аміду Кумамота. (б) Сямідзённыя расады дзікага тыпу Arabidopsis Columbia (Col) вырошчвалі на пласцінах Мурасіге і Скуга (MS), якія змяшчалі кумамонамід 6 або кумамонамід 1 у пазначаных канцэнтрацыях. Маштабная лінейка = 1 см.
Спачатку мы ацанілі біялагічную актыўнасць урбенаміду і яго прамежкавых прадуктаў на прадмет іх здольнасці мадуляваць рост раслін. Мы дадалі розныя канцэнтрацыі урсманаміду 1 або урсманавай кіслаты 6 у агаравае асяроддзе MS і культывавалі расаду Arabidopsis thaliana на гэтым асяроддзі. Гэтыя аналізы паказалі, што высокія канцэнтрацыі (500 мкМ) 6 інгібіруюць рост каранёў (мал. 2b). Далей мы стварылі розныя вытворныя, замяніўшы 6 у становішчы N1, і правялі даследаванні суадносін структуры і актыўнасці (працэс сінтэзу аналагаў апісаны ў дадатковай інфармацыі (SI)). Расаду Arabidopsis вырошчвалі на асяроддзі, якое змяшчала 50 мкМ вытворных урсонавай кіслаты, і вымяралі даўжыню каранёў, як паказана на малюнку. Як паказана на малюнках 3a, b і S1, кумамавыя кіслоты маюць розную даўжыню лінейных алкоксільных ланцугоў (9, 10, 11, 12 і 13) або вялікіх алкоксільных ланцугоў (15, 16 і 17) у становішчы N1. Вытворныя прадэманстравалі значнае тармажэнне росту каранёў. Акрамя таго, мы выявілі, што ўжыванне 200 мкМ 10, 11 або 17 тармазіла прарастанне (мал. 3c і S2).
Вывучэнне ўзаемасувязі структуры і актыўнасці аміду Кумамота і роднасных злучэнняў. (а) Структура і схема сінтэзу аналагаў. (б) Колькасная ацэнка даўжыні каранёў 7-дзённых расады, вырашчаных на асяроддзі MS з або без 50 мкМ вытворных кумамонаміду. Зорачкі паказваюць значныя адрозненні ў параўнанні з імітацыйнай апрацоўкай (t-крытэрый, p< 0,05). n>18. Дадзеныя паказаны ў выглядзе сярэдняга значэння ± стандартнае адхіленне. nt азначае «не праверана», бо больш за 50% насення не прарасло. (c) Колькасная ацэнка хуткасці прарастання апрацаванага насення, інкубаванага на працягу 7 дзён у асяроддзі MS з 200 мкМ кумамонаміду і роднасных злучэнняў або без іх. Зорачкі паказваюць значныя адрозненні ў параўнанні з імітацыйнай апрацоўкай (крытэрый хі-квадрат). n=96.
Цікава, што даданне алкільных бакавых ланцугоў, даўжэйшых за C9, зніжала інгібіруючую актыўнасць, што сведчыць аб тым, што злучэнні, роднасныя кумаматавай кіслаце, патрабуюць бакавых ланцугоў пэўнага памеру для праяўлення сваёй біялагічнай актыўнасці.
Паколькі аналіз суадносін структуры і актыўнасці паказаў, што C9 быў мадыфікаваны ў урсонавую кіслату, а нонілакс-вытворнае урсонавай кіслаты (далей KAND 11) з'яўляецца найбольш эфектыўным інгібітарам росту раслін, мы правялі больш падрабязную характарыстыку KAND 11. Апрацоўка Arabidopsis 50 мкМ KAND 11 амаль цалкам прадухіліла прарастанне, у той час як больш нізкія канцэнтрацыі (40, 30, 20 або 10 мкМ) KAND 11 інгібіравалі рост каранёў дозазалежным чынам (мал. 4a, b). Каб праверыць, ці ўплывае KAND 11 на жыццяздольнасць мерыстэмы каранёў, мы даследавалі мерыстэмы каранёў, афарбаваныя ёдыдам прапідыю (PI), і вымералі памер плошчы мерыстэмы. Памер мерыстэмы расады, вырашчанай на асяроддзі, якое змяшчала 25 мкМ KAND-11, склаў 151,1 ± 32,5 мкм, у той час як памер мерыстэмы расады, вырашчанай на кантрольным асяроддзі, якое змяшчала ДМСО, склаў 264,7 ± 30,8 мкм (мал. 4c, d), што сведчыць аб тым, што KAND-11 аднаўляе клеткавую актыўнасць. распаўсюджванне. Мерыстэма караня. У адпаведнасці з гэтым, апрацоўка KAND 11 знізіла колькасць сігналу маркера дзялення клетак CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS у мерыстэме караня (мал. 4e) 17. Гэтыя вынікі паказваюць, што KAND 11 інгібіруе рост каранёў, зніжаючы актыўнасць праліферацыі клетак.
Аналіз інгібіруючага ўплыву вытворных урбенанавай кіслаты (вытворных урбенілаксі) на рост. (а) 7-дзённыя праросткі Col дзікага тыпу, вырашчаныя на пласцінах MS з пазначанымі канцэнтрацыямі KAND 11. Маштабная лінейка = 1 см. (б) Колькасная ацэнка даўжыні каранёў. Літары паказваюць значныя адрозненні (тэст Цьюкі HSD, p< 0,05). n>16. Дадзеныя паказаны ў выглядзе сярэдняга значэння ± SD. (c) Канфакальная мікраскапія каранёў дзікага тыпу Col, афарбаваных ёдыдам прапідыю, вырашчаных на пласцінах MS з 25 мкМ KAND 11 або без яго. Белыя дужкі паказваюць мерыстэму кораня. Маштабная лінейка = 100 мкм. (d) Колькасная ацэнка памеру мерыстэмы кораня (n = ад 10 да 11). Статыстычныя адрозненні былі вызначаны з дапамогай t-крытэрыя (p< 0,05). Слупкі адлюстроўваюць сярэдні памер мерыстэмы. (e) Дыферэнцыяльная інтэрферэнцыйна-кантрастная (DIC) мікраскапія мерыстэмы кораня, якая змяшчае канструкт CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS афарбоўка і афарбоўка 5-дзённых расады, вырашчанай на пласцінах MS з выкарыстаннем або без аналізу KAND 25 мкМ.
Фітатаксічнасць KAND 11 была дадаткова праверана з выкарыстаннем іншай двухдольнай расліны — тытуню (Nicotiana tabacum) і асноўнага мадэльнага арганізма наземнай расліны — пячоначніка (Marchantia polymorpha). Як і ў выпадку з Arabidopsis, расада тытуню SR-1, вырашчаная на асяроддзі, якое змяшчала 25 мкМ KAND 11, мела карацейшыя карані (мал. 5a). Акрамя таго, 40 з 48 насення прарасло на пласцінах, якія змяшчалі 200 мкМ KAND 11, у той час як усе 48 насення прараслі на імітацыйных асяроддзях, што сведчыць аб значных значэннях больш высокіх канцэнтрацый KAND (p< 0,05; крытэрый хі-квадрат) інгібіраваў прарастанне тытуню (мал. 5b). Акрамя таго, канцэнтрацыя KAND 11, якая інгібіравала рост бактэрый у пячоначніку, была падобная да эфектыўнай канцэнтрацыі ў Arabidopsis (мал. 5c). Гэтыя вынікі паказваюць, што KAND 11 можа інгібіраваць рост розных раслін. Затым мы даследавалі магчымую цытатаксічнасць злучэнняў, звязаных з монаамідам мядзведзя, у іншых арганізмах, а менавіта ў клетках HeLa чалавека і штаме Escherichia coli DH5α, як прадстаўніках вышэйшых жывёльных і бактэрыяльных клетак адпаведна. У серыі аналізаў праліферацыі клетак мы назіралі, што кумамонамід 1, кумамонамідавая кіслата 6 і KAND 11 не ўплывалі на рост клетак HeLa або E. coli пры канцэнтрацыях 100 мкМ (мал. 5d,e).
Інгібіраванне росту KAND 11 у арганізмаў, якія не адносяцца да Arabidopsis. (a) Двухтыднёвыя расады тытуню дзікага тыпу SR-1 вырошчвалі на вертыкальна размешчаных пласцінах MS, якія змяшчалі 25 мкМ KAND 11. (b) Двухтыднёвыя расады тытуню дзікага тыпу SR-1 вырошчвалі на гарызантальна размешчаных пласцінах MS, якія змяшчалі 200 мкМ KAND 11. (c) Двухтыднёвыя пупышкі пячоначніка дзікага тыпу Tak-1, вырашчаныя на пласцінах Gamborg B5 з пазначанымі канцэнтрацыямі KAND 11. Чырвоныя стрэлкі паказваюць споры, якія спынілі рост на працягу двухтыднёвага інкубацыйнага перыяду. (d) Аналіз праліферацыі клетак HeLa. Колькасць жыццяздольных клетак вымяралі праз фіксаваныя прамежкі часу з дапамогай набору для падліку клетак 8 (Dojindo). У якасці кантролю клеткі HeLa апрацоўвалі 5 мкг/мл актынаміцыну D (Act D), які інгібіруе транскрыпцыю РНК-палімеразы і выклікае гібель клетак. Аналізы праводзілі ў трох паўторах. (e) Аналіз праліферацыі клетак E. coli. Рост E. coli аналізавалі шляхам вымярэння OD600. У якасці кантролю клеткі апрацоўвалі 50 мкг/мл ампицилина (Amp), які інгібіруе сінтэз клеткавай сценкі бактэрый. Аналізы праводзілі ў трох паўторах.
Каб расшыфраваць механізм дзеяння цытатаксічнасці, выкліканай злучэннямі, звязанымі з урамідам, мы паўторна прааналізавалі вытворныя урбенавай кіслаты з умераным інгібіруючым эфектам, як паказана на малюнку. Як паказана на малюнках 2b, 6a, расада, вырашчаная на агаравых пласцінках, якія змяшчаюць высокія канцэнтрацыі (200 мкМ) урматонавай кіслаты 6, давала карацейшыя і загнутыя ўлева карані (θ = –23,7 ± 6,1), тады як расада, вырашчаная на кантрольным асяроддзі, давала амаль прамыя карані (θ = –3,8 ± 7,1). Вядома, што гэты характэрны касы рост з'яўляецца вынікам дысфункцыі коркавых мікратрубачак14,18. У адпаведнасці з гэтай высновай, прэпараты, якія дэстабілізуюць мікратрубачкі, дызапірамід і арызалін, выклікалі падобны нахіл каранёў у нашых умовах росту (мал. 2b, 6a). У той жа час мы пратэставалі вытворныя урманатонавай кіслаты і адабралі некалькі з іх, якія пры пэўных канцэнтрацыях выклікалі касы рост каранёў. Злучэнні 8, 9 і 15 змянілі кірунак росту каранёў пры 75 мкМ, 50 мкМ і 40 мкМ адпаведна, што сведчыць аб тым, што гэтыя злучэнні могуць эфектыўна дэстабілізаваць мікратрубачкі (мал. 2b, 6a). Мы таксама пратэставалі найбольш магутнае вытворнае урсолавай кіслаты, KAND 11, пры больш нізкай канцэнтрацыі (15 мкМ) і выявілі, што ўжыванне KAND 11 інгібіруе рост каранёў, і што кірунак росту каранёў быў нераўнамерным, хоць яны і мелі тэндэнцыю да нахілу налева (мал. C3). Паколькі больш высокія канцэнтрацыі прэпаратаў, якія дэстабілізуюць мікратрубачкі, часам інгібіруюць рост раслін, а не выклікаюць нахіл каранёў, мы пасля ацанілі магчымасць таго, што KAND 11 уплывае на мікратрубачкі, назіраючы за коркавымі мікратрубачкамі ў эпідэрмальных клетках кораня. Імунагістахімія з выкарыстаннем антыцелаў супраць β-тубуліну ў эпідэрмальных клетках каранёў расады, апрацаваных 25 мкМ KAND 11, паказала знікненне амаль усіх коркавых мікратрубачак у эпідэрмальных клетках у зоне падаўжэння (мал. 6b). Гэтыя вынікі паказваюць, што кумаматанавая кіслата і яе вытворныя ўздзейнічаюць непасрэдна або ўскосна на мікратрубачкі, парушаючы іх працу, і што гэтыя злучэнні з'яўляюцца новымі інгібітарамі мікратрубачак.
Урсонавая кіслата і яе вытворныя змяняюць кортикальныя мікратрубачкі ў Arabidopsis thaliana. (а) Кут нахілу кораня, вымераны ў прысутнасці розных вытворных урматонавай кіслаты ў пазначаных канцэнтрацыях. Таксама быў прааналізаваны ўплыў двух злучэнняў, якія, як вядома, інгібіруюць мікратрубачкі: дызапіраміду і арызаліну. На ўстаўцы паказаны стандарт, які выкарыстоўваецца для вымярэння вугла росту кораня. Зорачкі паказваюць значныя адрозненні ў параўнанні з імітацыйнай апрацоўкай (t-крытэрый, p< 0,05). n>19. Маштабная лінейка = 1 см. (b) Кортыкальныя мікратрубачкі ў эпідэрмальных клетках у зоне падаўжэння. Мікратрубачкі ў каранях Arabidopsis Col дзікага тыпу, вырашчаных на пласцінах MS з 25 мкМ KAND 11 або без яго, візуалізавалі з дапамогай імунагістахімічнага афарбоўвання з выкарыстаннем першасных антыцелаў да β-тубуліну і другасных антыцелаў, кан'югаваных з Alexa Fluor. Маштабная лінейка = 10 мкм. (c) Мітатычная структура мікратрубачак у мерыстэме кораня. Мікратрубачкі візуалізавалі з дапамогай імунагістахімічнага афарбоўвання. Мітатычныя структуры, у тым ліку прафазныя зоны, верацяна і фрагмапласты, падлічвалі па канфакальных выявах. Стрэлкі паказваюць мітатычныя структуры мікратрубачак. Зорачкі паказваюць значныя адрозненні ў параўнанні з імітацыйным лячэннем (t-крытэрый, p< 0,05). n>9. Маштабная лінейка = 50 мкм.
Нягледзячы на тое, што Ursa мае здольнасць парушаць функцыю мікратрубачак, чакаецца, што механізм яе дзеяння будзе адрознівацца ад тыповых агентаў для дэпалімерызацыі мікратрубачак. Напрыклад, больш высокія канцэнтрацыі агентаў для дэпалімерызацыі мікратрубачак, такіх як дызапірамід і арызалін, выклікаюць анізатропнае пашырэнне эпідэрмальных клетак, у той час як KAND 11 гэтага не робіць. Акрамя таго, сумеснае прымяненне KAND 11 і дызапіраміду прывяло да камбінаванай рэакцыі росту каранёў, выкліканай дызапірамідам, і назіралася тармажэнне росту, выкліканае KAND 11 (мал. S4). Мы таксама прааналізавалі рэакцыю гіперадчувальнага мутанта дызапіраміду 1-1 (phs1-1) на KAND 11. phs1-1 мае некананічную кропкавую мутацыю тубулінкіназы і ўтварае карацейшыя карані пры апрацоўцы дызапірамідам9,20. Расада мутанта phs1-1, вырашчаная на агаравым асяроддзі, якое змяшчае KAND 11, мела карацейшыя карані, падобныя да тых, што вырашчаныя на дызапірамідзе (мал. S5).
Акрамя таго, у каранёвай мерыстэме расады, апрацаванай KAND 11, мы назіралі мітатычныя структуры мікратрубачак, такія як прафазныя зоны, верацяна і фрагмапласты. У адпаведнасці з назіраннямі для CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS назіралася значнае зніжэнне колькасці мітатычных мікратрубачак (мал. .6c).
Каб ахарактарызаваць цытатаксічнасць KAND 11 пры субклеткавым дазволе, мы апрацавалі суспензійныя клеткі тытуню BY-2 з дапамогай KAND 11 і назіралі за іх рэакцыяй. Спачатку мы дадалі KAND 11 да клетак BY-2, якія экспрэсуюць TagRFP-TUA6, які флуарэсцэнтна маркіруе мікратрубачкі, каб ацаніць уплыў KAND 11 на кортыкальныя мікратрубачкі. Шчыльнасць кортыкальных мікратрубачак ацэньвалася з дапамогай аналізу малюнкаў, які колькасна вызначаў працэнт пікселяў цыташкілета сярод цытаплазматычных пікселяў. Вынікі аналізу паказалі, што пасля апрацоўкі 50 мкМ або 100 мкМ KAND 11 на працягу 1 гадзіны шчыльнасць значна знізілася да 0,94 ± 0,74% або 0,23 ± 0,28% адпаведна, у той час як шчыльнасць клетак, апрацаваных ДМСО, склала 1,61 ± 0,34% (мал. 7a). Гэтыя вынікі адпавядаюць назіранню ў Arabidopsis, што апрацоўка KAND 11 выклікае дэпалімерызацыю кортыкальных мікратрубачак (мал. 6b). Мы таксама даследавалі лінію BY-2 з актынавымі філаментамі, мечанымі GFP-ABD, пасля апрацоўкі такой жа канцэнтрацыяй KAND 11 і назіралі, што апрацоўка KAND 11 парушае актынавыя філаменты. Апрацоўка 50 мкМ або 100 мкМ KAND 11 на працягу 1 гадзіны значна знізіла шчыльнасць актынавых філаментаў да 1,20 ± 0,62% або 0,61 ± 0,26% адпаведна, у той час як шчыльнасць у клетках, апрацаваных ДМСО, складала 1,69 ± 0,51% (мал. 2). 7b). Гэтыя вынікі кантрастуюць з эфектамі прапізаміду, які не ўплывае на актынавыя філаменты, і латрункуліну B, дэпалімерызатара актыну, які не ўплывае на мікратрубачкі (малюнак SI S6). Акрамя таго, апрацоўка кумаманамідам 1, кумаманамідавай кіслатой 6 або KAND 11 не паўплывала на мікратрубачкі ў клетках HeLa (малюнак SI S7). Такім чынам, лічыцца, што механізм дзеяння KAND 11 адрозніваецца ад механізму вядомых парушальнікаў цыташкілета. Акрамя таго, нашы мікраскапічныя назіранні за клеткамі BY-2, апрацаванымі KAND 11, выявілі пачатак гібелі клетак падчас апрацоўкі KAND 11 і паказалі, што доля мёртвых клетак, афарбаваных сінім Эвансам, не павялічылася істотна пасля 30 хвілін апрацоўкі KAND 11, тады як пасля 90 хвілін апрацоўкі 50 мкМ або 100 мкМ KAND колькасць мёртвых клетак павялічылася да 43,7% або 80,1% адпаведна (мал. 7c). Узятыя разам, гэтыя дадзеныя сведчаць аб тым, што новае вытворнае урсолавай кіслаты KAND 11 з'яўляецца спецыфічным для раслін інгібітарам цыташкілета з раней невядомым механізмам дзеяння.
KAND уплывае на кортикальныя мікратрубачкі, актынавыя філаменты і жыццяздольнасць клетак тытуню BY-2. (a) Візуалізацыя кортикальных мікратрубачак у клетках BY-2 у прысутнасці TagRFP-TUA6. Клеткі BY-2, апрацаваныя KAND 11 (50 мкМ або 100 мкМ) або DMSO, даследавалі з дапамогай канфакальнай мікраскапіі. Шчыльнасць кортикальных мікратрубачак разлічвалі па мікрафатаграфіях 25 незалежных клетак. Літары абазначаюць значныя адрозненні (тэст Цьюкі HSD, p< 0,05). Маштабная лінейка = 10 мкм. (b) Картыкальныя актынавыя філаменты ў клетках BY-2, візуалізаваныя ў прысутнасці GFP-ABD2. Клеткі BY-2, апрацаваныя KAND 11 (50 мкМ або 100 мкМ) або DMSO, даследавалі з дапамогай канфакальнай мікраскапіі. Шчыльнасць картыкальных актынавых філаментаў была разлічана па мікрафатаграфіях 25 незалежных клетак. Літары абазначаюць значныя адрозненні (тэст Цьюкі HSD, p< 0,05). Маштабная лінейка = 10 мкм. (c) Назіранне за мёртвымі клеткамі BY-2 з дапамогай афарбоўвання сінім Эвансам. Клеткі BY-2, апрацаваныя KAND 11 (50 мкМ або 100 мкМ) або ДМСО, даследавалі з дапамогай светлапольнай мікраскапіі. n = 3. Маштабная лінейка = 100 мкм.
Адкрыццё і прымяненне новых прыродных прадуктаў прывялі да значнага прагрэсу ў розных аспектах жыцця чалавека, у тым ліку ў медыцыне і сельскай гаспадарцы. Былі праведзены гістарычныя даследаванні для атрымання карысных злучэнняў з прыродных рэсурсаў. У прыватнасці, актынаміцэты вядомыя сваёй карыснасцю ў якасці супрацьпаразітарных антыбіётыкаў супраць нематод дзякуючы сваёй здольнасці выпрацоўваць розныя другасныя метабаліты, такія як авермектын, вядучае злучэнне івермектыну, і блеаміцын і яго вытворныя, якія выкарыстоўваюцца ў медыцыне ў якасці супрацьракавага сродку21,22. Аналагічна, з актынаміцэтаў былі выяўлены розныя гербіцыдныя злучэнні, некаторыя з якіх ужо выкарыстоўваюцца ў камерцыйных мэтах1,23. Такім чынам, аналіз метабалітаў актынаміцэтаў для вылучэння прыродных прадуктаў з жаданай біялагічнай актыўнасцю лічыцца эфектыўнай стратэгіяй. У гэтым даследаванні мы выявілі новае злучэнне, кумамонамід, з S. werraensis і паспяхова сінтэзавалі яго. Урсонавая кіслата - гэта сінтэтычны прамежкавы прадукт урбенаміду і яго вытворных. Яна можа выклікаць характэрнае скручванне каранёў, праяўляць умераную або моцную гербіцыдную актыўнасць і непасрэдна або ўскосна пашкоджваць мікратрубачкі раслін. Аднак механізм дзеяння ўрматонавай кіслаты можа адрознівацца ад механізму існуючых інгібітараў мікратрубачак, паколькі KAND 11 таксама парушае актынавыя філаменты і выклікае гібель клетак, што сведчыць аб рэгуляторным механізме, з дапамогай якога ўрматонавай кіслаты і яе вытворных уплываюць на шырокі спектр структур цыташкілета.
Далейшая падрабязная характарыстыка ўрбенанавай кіслаты дапаможа лепш зразумець механізм яе дзеяння. У прыватнасці, наступная мэта — ацаніць здольнасць урсонавай кіслаты звязвацца з адноўленымі мікратрубачкамі, каб вызначыць, ці дзейнічае ўрсонавая кіслата і яе вытворныя непасрэдна на мікратрубачкі і дэпалімерызуе іх, ці ж іх дзеянне прыводзіць да дэстабілізацыі мікратрубачак. Акрамя таго, у выпадку, калі мікратрубачкі не з'яўляюцца непасрэднай мішэнню, вызначэнне месца дзеяння і малекулярных мішэняў урсонавай кіслаты на раслінных клетках дапаможа лепш зразумець уласцівасці роднасных злучэнняў і магчымыя спосабы паляпшэння гербіцыднай актыўнасці. Наш аналіз біялагічнай актыўнасці паказаў унікальную цытатаксічную здольнасць урсонавай кіслаты ўплываць на рост такіх раслін, як Arabidopsis thaliana, тытунь і пячоначнік, у той час як ні клеткі E. coli, ні клеткі HeLa не пацярпелі. Малая або адсутная таксічнасць для жывёльных клетак з'яўляецца перавагай вытворных урсонавай кіслаты, калі яны распрацоўваюцца ў якасці гербіцыдаў для выкарыстання на адкрытых сельскагаспадарчых палях. Сапраўды, паколькі мікратрубачкі з'яўляюцца распаўсюджанымі структурамі ў эўкарыёт, іх селектыўнае інгібіраванне ў раслінах з'яўляецца ключавым патрабаваннем да гербіцыдаў. Напрыклад, прапізмід, агент дэпалімерызацыі мікратрубачак, які непасрэдна звязваецца з тубулінам і інгібіруе палімерызацыю, выкарыстоўваецца ў якасці гербіцыду з-за яго нізкай таксічнасці для жывёльных клетак24. У адрозненне ад дызапіраміду, роднасныя бензаміды маюць розную мэтавую спецыфічнасць. Акрамя раслінных мікратрубачак, RH-4032 або бензаксамід таксама інгібіруе мікратрубачкі жывёльных клетак або ооміцэтаў адпаведна, а заліламід выкарыстоўваецца ў якасці фунгіцыду з-за яго нізкай фітатаксічнасці25,26,27. Нядаўна адкрыты мядзведзь і яго вытворныя праяўляюць селектыўную цытатаксічнасць у дачыненні да раслін, але варта адзначыць, што далейшыя мадыфікацыі могуць змяніць іх мэтавую спецыфічнасць, патэнцыйна забяспечваючы дадатковыя вытворныя для кантролю патагенных грыбоў або ооміцэтаў.
Унікальныя ўласцівасці урбенонавай кіслаты і яе вытворных карысныя для іх распрацоўкі ў якасці гербіцыдаў і выкарыстання ў якасці даследчых інструментаў. Важнасць цыташкілета ў кантролі формы раслінных клетак шырока прызнана. Папярэднія даследаванні паказалі, што расліны развілі складаныя механізмы арганізацыі коркавых мікратрубачак, кантралюючы дынаміку мікратрубачак для належнага кантролю морфагенезу. Была выяўлена вялікая колькасць малекул, адказных за рэгуляцыю актыўнасці мікратрубачак, і адпаведныя даследаванні ўсё яшчэ працягваюцца3,4,28. Наша сучаснае разуменне дынамікі мікратрубачак у раслінных клетках не цалкам тлумачыць механізмы арганізацыі коркавых мікратрубачак. Напрыклад, хоць і дызапірамід, і арызалін могуць дэпалімерызаваць мікратрубачкі, дызапірамід выклікае сур'ёзнае дэфармаванне каранёў, у той час як арызалін мае адносна мяккі эфект. Больш за тое, мутацыі ў тубуліне, які стабілізуе мікратрубачкі, таксама выклікаюць дэкстраратацыю каранёў, тады як паклітаксел, які таксама стабілізуе дынаміку мікратрубачак, не выклікае гэтага. Такім чынам, вывучэнне і ідэнтыфікацыя малекулярных мішэняў урсолавай кіслаты павінна даць новае разуменне рэгуляцыі коркавых мікратрубачак раслін. Аналагічным чынам, будучыя параўнанні хімічных рэчываў, якія эфектыўна спрыяюць скажонаму росту, такіх як дызапірамід, і менш эфектыўных хімічных рэчываў, такіх як арызалін або кумаматорная кіслата, дадуць падказкі аб тым, як адбываецца скажэнне росту.
З іншага боку, звязаныя з абаронай перабудовы цыташкілета — яшчэ адна магчымасць растлумачыць цытатаксічнасць урсонавай кіслаты. Інфекцыя патагенам або ўвядзенне элісітара ў раслінныя клеткі часам выклікае разбурэнне цыташкілета і наступную гібель клетак29. Напрыклад, паведамлялася, што крыптаксанцін, атрыманы з ооміцетаў, парушае мікратрубачкі і актынавыя філаменты перад гібеллю клетак тытуню, падобна таму, што адбываецца пры апрацоўцы KAND30,31. Падабенства паміж ахоўнымі рэакцыямі і клеткавымі рэакцыямі, выкліканымі ўрсонавай кіслатой, прывяло нас да гіпотэзы, што яны запускаюць агульныя клеткавыя працэсы, хоць відавочны больш хуткі і моцны эфект урсонавай кіслаты, чым крыптаксанціну. Аднак даследаванні паказалі, што парушэнне актынавых філаментаў спрыяе спантаннай гібелі клетак, якая не заўсёды суправаджаецца парушэннем мікратрубачак29. Акрамя таго, яшчэ трэба высветліць, ці выклікае патаген або элісітар скажэнне росту каранёў, як гэта робяць вытворныя ўрсонавай кіслаты. Такім чынам, малекулярныя веды, якія звязваюць ахоўныя рэакцыі і цыташкілет, з'яўляюцца прывабнай праблемай, якую трэба вырашыць. Выкарыстоўваючы прысутнасць нізкамалекулярных злучэнняў, роднасных урсонавай кіслаце, а таксама шэраг вытворных з рознай патэнцыяй, яны могуць даць магчымасці для ўздзеяння на невядомыя клеткавыя механізмы.
У цэлым, адкрыццё і прымяненне новых злучэнняў, якія мадулююць дынаміку мікратрубачак, забяспечаць магутныя метады для вызначэння складаных малекулярных механізмаў, якія ляжаць у аснове вызначэння формы раслінных клетак. У гэтым кантэксце нядаўна распрацаванае злучэнне ўрматонавая кіслата, якое ўздзейнічае на мікратрубачкі і актынавыя філаменты і выклікае гібель клетак, можа даць магчымасць расшыфраваць сувязь паміж кантролем мікратрубачак і гэтымі іншымі механізмамі. Такім чынам, хімічны і біялагічны аналіз з выкарыстаннем урбенонавай кіслаты дапаможа нам зразумець малекулярныя рэгуляторныя механізмы, якія кантралююць цыташкілет раслін.
Інакулюйце S. werraensis MK493-CF1 у колбу Эрленмейера з перагародкай аб'ёмам 500 мл, якая змяшчае 110 мл пасяўнога асяроддзя, якое складаецца з 2% (мас./аб.) галактозы, 2% (мас./аб.) пасты Essence, 1% (мас./аб.) складу Bacto.-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (мас./аб.) экстракта кукурузы (KOGOSTCH Co., Ltd., Японія), 0,2% (мас./аб.) (NH4)2SO4 і 0,2% CaCO3 у дэіянізаванай вадзе. (pH 7,4 перад стэрылізацыяй). Пасяўныя культуры інкубавалі на ратацыйнай качалцы (180 аб/мін) пры тэмпературы 27°C на працягу 2 дзён. Вытворчае культываванне метадам цвёрдафазнай ферментацыі. Пасеў (7 мл) перанеслі ў колбу К-1 аб'ёмам 500 мл, якая змяшчала 40 г вытворчага асяроддзя, якое складалася з 15 г прэсаванага ячменю (MUSO Co., Ltd., Японія) і 25 г дэіянізаванай вады (pH не карэктаваўся перад стэрылізацыяй). Ферментацыю праводзілі пры тэмпературы 30°C у цемры на працягу 14 дзён. Ферментаваны матэрыял экстрагавалі 40 мл/бутэльку этанолу і цэнтрыфугавалі (1500 г, 4°C, 10 хвілін). Супернатант культуры (60 мл) экстрагавалі сумессю 10% MeOH/EtOAc. Арганічны пласт выпарвалі пад паніжаным ціскам з атрыманнем астатку (59,5 мг), які падвяргалі ВЭЖХ з градыентным элюаваннем (0–10 хвілін: 90%) на калонцы з адваротнай фазай (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 мкм, унутраны дыяметр 10 мм × даўжыня 250 мм) H2O/CH3CN, 10–35 хвілін: 90% H2O/CH3CN да 70% H2O/CH3CN (градыент), 35–45 хвілін: 90% H2O/EtOH, 45–155 хвілін: 90% H2O/EtOH да 100% EtOH (градыент (градыент), 155–200 хвілін: 100% EtOH) пры хуткасці патоку 1,5 мл/мін, кумамонамід (1, 36,0 мг) быў выдзелены ў выглядзе белага аморфнага парашка.
Кумамотаамід(1); 1H-ЯМР (500 МГц, CDCl3) δ 6,93 (т, J = 2,5 Гц, 1H), 6,76 (дд, J = 4,3, 1,8 Гц 1H), 6,05 (т, J = 3,8 Гц, 1H), 4,08 (с, 3H); 13C-ЯМР (125 МГц, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ разліковае значэнне: 141,0659, вымеранае значэнне: 141,0663, ІЧ νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 см–1.
Насенне Columbia (Col-0) было атрымана з Цэнтра біялагічных рэсурсаў Arabidopsis (ABRC) з дазволу на выкарыстанне ў даследаваннях. Насенне Col-0 было размнажана і вырошчвана ў нашых лабараторных умовах і выкарыстоўвалася ў якасці раслін Arabidopsis дзікага тыпу. Насенне Arabidopsis было павярхоўна стэрылізавана і культывавана ў асяроддзі Murashige і Skoog палавіннай канцэнтрацыі, якое змяшчала 2% цукрозы (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (мас./аб.) 2-(4-марфаліна)этансульфонавай кіслаты (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). і 1,5% агара (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, пры тэмпературы 23 °C і пастаянным асвятленні. Насенне мутанта phs1-1 было прадастаўлена Т. Хашымота (Нарскі інстытут навукі і тэхналогій).
Насенне штама SR-1 было прадастаўлена Т. Хашымота (Нарскі інстытут навукі і тэхналогій) і выкарыстана ў якасці раслін тытуню дзікага тыпу. Насенне тытуню было павярхоўна стэрылізавана і замочана ў стэрыльнай вадзе на тры ночы для садзейнічання прарастанню, затым змешчана ў раствор палавіннай канцэнтрацыі, які змяшчае 2% цукрозы, 0,05% (мас./аб.) MES і 0,8% геланавай гумы (Fujifilm Wako Pure Chemical) Мурасіге і асяроддзе Скуга) з pH 5,7 і інкубавана пры тэмпературы 23°C пры пастаянным асвятленні.
Штам Tak-1 быў прадастаўлены Т. Кохчы (Кіёцкі ўніверсітэт) і выкарыстоўваўся ў якасці стандартнай эксперыментальнай адзінкі для даследавання пячоначніка. Гема была атрымана са стэрылізаваных культурных раслін, а затым высеяна на асяроддзе Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical), якое змяшчае 1% цукрозы і 0,3% геланавай гумы, і інкубавана пры тэмпературы 23°C пад пастаянным святлом.
Клеткі тытуню BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) былі прадастаўлены С. Хасэзавай (Токійскі ўніверсітэт). Клеткі BY-2 былі разведзены ў 95 разоў у мадыфікаваным асяроддзі Лінсмайера і Скуга і штотыдзень дадаваліся 2,4-дыхлорфенаксівоцатная кіслата 32. Клетачную суспензію змешвалі на ратацыйным шейкеры пры 130 аб/мін пры тэмпературы 27°C у цемры. Прамывалі клеткі аб'ёмам свежага асяроддзя ў 10 разоў і рэсуспендавалі ў тым жа асяроддзі. Трансгенныя клеткавыя лініі BY-2, якія стабільна экспрэсуюць маркер мікратрубачак TagRFP-TUA6 або маркер актынавых філаментаў GFP-ABD2 пад прамотарам віруса мазаікі каляровай капусты 35S, былі атрыманы, як апісана 33, 34, 35. Гэтыя клеткавыя лініі можна падтрымліваць і сінхранізаваць з выкарыстаннем працэдур, падобных да тых, што выкарыстоўваліся для зыходнай клеткавай лініі BY-2.
Клеткі HeLa культывавалі ў мадыфікаваным асяроддзі Ігла Дульбека (DMEM) (Life Technologies) з дадаткам 10% фетальнай бычынай сыроваткі, 1,2 адзінак/мл пеніцыліну і 1,2 мкг/мл стрэптаміцыну ў інкубатары пры тэмпературы 37°C з 5% CO2.
Усе эксперыменты, апісаныя ў гэтым рукапісе, былі праведзены ў адпаведнасці з японскімі правіламі і рэкамендацыямі па біябяспецы.
Злучэнні растваралі ў дыметылсульфаксідзе (ДМСО; Fujifilm Wako Pure Chemical) у выглядзе маткавых раствораў і разводзілі ў асяроддзі MS для Arabidopsis і тытуню або ў асяроддзі Gamborg B5 для пячоначніка. Для аналізу інгібіравання росту каранёў больш за 10 насення на пласцінку высейвалі на агаравае асяроддзе, якое змяшчала пазначаныя злучэнні або ДМСО. Насенне інкубавалі ў роставай камеры на працягу 7 дзён. Расаду фатаграфавалі, і вымяралі даўжыню каранёў. Для аналізу прарастання Arabidopsis 48 насення на пласцінку высейвалі на агаравае асяроддзе, якое змяшчала 200 мкМ злучэння або ДМСО. Насенне Arabidopsis вырошчвалі ў роставай камеры, і колькасць прарослых расады падлічвалі праз 7 дзён пасля прарастання (dag). Для аналізу прарастання тытуню 24 насенне на пласцінку высейвалі на агаравае асяроддзе, якое змяшчала 200 мкМ KAND або ДМСО. Насенне тытуню вырошчвалі ў роставай камеры, і колькасць прарослых расады падлічвалі праз 14 дзён. Для аналізу інгібіравання росту пячоначніка 9 эмбрыёнаў з кожнай пласціны высейвалі на агаравае асяроддзе, якое змяшчала пазначаныя канцэнтрацыі KAND або DMSO, і інкубавалі ў роставай камеры на працягу 14 дзён.
Для візуалізацыі арганізацыі мерыстэмы каранёў выкарыстоўвалі расаду, афарбаваную 5 мг/мл ёдыдам прапідыю (PI). Сігналы PI назіралі з дапамогай флуарэсцэнтнай мікраскапіі з выкарыстаннем канфакальнага лазернага сканавальнага мікраскопа TCS SPE (Leica Microsystems).
Гістахімічнае афарбоўванне каранёў β-глюкуронідазай (GUS) праводзілі ў адпаведнасці з пратаколам, апісаным Маламі і Бенфеем36. Расаду фіксавалі ў 90% ацэтоне на працягу ночы, афарбоўвалі 0,5 мг/мл 5-бром-4-хлор-3-індоліл-β-d-глюкуронавай кіслаты ў буферы GUS на працягу 1 гадзіны і змяшчалі ў гідратаваны раствор хларальдэгіду (8 г хлоральгідрату, 2 мл вады і 1 мл гліцэрыны) і назіралі з дапамогай дыферэнцыяльнай інтэрферэнцыйна-кантрастнай мікраскапіі з выкарыстаннем мікраскопа Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Вуглы нахілу каранёў вымяраліся на 7-дзённых расадах, вырашчаных на вертыкальна размешчаных пласцінах. Вымерайце вугал нахілу кораня адносна кірунку вектара сілы цяжару, як апісана ў кроку 6.
Размяшчэнне коркавых мікратрубачак назіралася, як апісана, з невялікімі зменамі ў пратаколе 37. Антыцелы супраць β-тубуліну (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) і кан'югаваныя з Alexa Fluor 488 антыцелы супраць мышынага IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) выкарыстоўваліся ў якасці першасных і другасных антыцелаў у развядзеннях 1:1000 і 1:100 адпаведна. Флуарэсцэнтныя выявы былі атрыманы з дапамогай канфакальнага лазернага сканавальнага мікраскопа TCS SPE (Leica Microsystems). Атрымайце Z-стак-выявы і стварыце праекцыі максімальнай інтэнсіўнасці ў адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы.
Аналіз праліферацыі клетак HeLa праводзілі з выкарыстаннем набору для падліку клетак Cell Counting Kit 8 (Dojindo) у адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы.
Рост E. coli DH5α аналізавалі шляхам вымярэння шчыльнасці клетак у культуры з дапамогай спектрафатометра пры 600 нм (OD600).
Арганізацыя цыташкілета ў трансгенных клетках BY-2 назіралася з дапамогай флуарэсцэнтнага мікраскопа, абсталяванага канфакальнай сканіруючай прыладай CSU-X1 (Yokogawa) і sCMOS-камерай (Zyla, Andor Technology). Шчыльнасць цыташкілета ацэньвалася з дапамогай аналізу малюнкаў, які колькасна вызначаў працэнт пікселяў цыташкілета сярод цытаплазматычных пікселяў на канфакальных малюнках з выкарыстаннем праграмнага забеспячэння ImageJ, як апісана38,39.
Для выяўлення гібелі клетак у клетках BY-2 аліквоту клетачнай суспензіі інкубавалі з 0,05% сінім Эванса на працягу 10 хвілін пры пакаёвай тэмпературы. Селектыўнае афарбоўванне сінім Эванса мёртвых клетак залежыць ад экструзіі фарбавальніка з жыццяздольных клетак непашкоджанай плазматычнай мембранай40. Афарбаваныя клеткі назіралі з дапамогай светлапольнага мікраскопа (BX53, Olympus).
Клеткі HeLa вырошчвалі ў DMEM з даданнем 10% FBS у ўвільготненым інкубатары пры тэмпературы 37°C і 5% CO2. Клеткі апрацоўвалі 100 мкМ KAND 11, кумамонамідавай кіслатой 6, кумамонамідам 1, 100 нг/мл кальцэміду (Gibco) або 100 нг/мл Nocodmaze (Sigma) на працягу 6 гадзін пры 37°C. Клеткі фіксавалі MetOH на працягу 10 хвілін, а затым ацэтатам на працягу 5 хвілін пры пакаёвай тэмпературы. Фіксаваныя клеткі інкубавалі з першаснымі антыцеламі да β-тубуліну (1D4A4, Proteintech: 66240-1), разведзенымі ў 0,5% BSA/PBS, на працягу 2 гадзін, прамывалі 3 разы TBST, а затым інкубавалі з казінымі антыцеламі Alexa Fluor. 488 на працягу 1 гадзіны. – Мышыны IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) і 15 нг/мл 4′,6-дыямідына-2-феніліндолу (DAPI), разведзенага ў 0,5% BSA/PBS. Пасля трохразовага прамывання TBST афарбаваныя клеткі назіралі на інвертаваным мікраскопе Nikon Eclipse Ti-E. Здымкі былі атрыманы з дапамогай астуджанай CCD-камеры Hamamatsu ORCA-R2 з выкарыстаннем праграмнага забеспячэння MetaMorph (Molecular Devices).
Час публікацыі: 17 чэрвеня 2024 г.