Дзякуй за наведванне Nature.com.Версія браўзера, якой вы карыстаецеся, мае абмежаваную падтрымку CSS.Для дасягнення найлепшых вынікаў мы рэкамендуем вам выкарыстоўваць больш новую версію вашага браўзера (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer).Тым часам, каб забяспечыць пастаянную падтрымку, мы паказваем сайт без стылізацыі і JavaScript.
Адкрыццё і карыснае выкарыстанне натуральных прадуктаў можа дапамагчы палепшыць жыццё чалавека.Хімікаты, якія інгібіруюць рост раслін, шырока выкарыстоўваюцца ў якасці гербіцыдаў для барацьбы з пустазеллем.У сувязі з неабходнасцю выкарыстання розных тыпаў гербіцыдаў, узнікае неабходнасць ідэнтыфікацыі злучэнняў з новымі механізмамі дзеяння.У гэтым даследаванні мы адкрылі новае злучэнне N-алкаксіпіролу, кумаманамід, з Streptomyces werraensis MK493-CF1 і ўсталявалі поўны працэс сінтэзу.З дапамогай аналізаў біялагічнай актыўнасці мы выявілі, што ўрс-монаамінавая кіслата з'яўляецца сінтэтычным прамежкавым прадуктам урс-монааміду і патэнцыяльнымінгібітар росту раслін.Акрамя таго, мы распрацавалі розныя вытворныя урбенонавай кіслаты, у тым ліку вытворнае урбенілаксі (UDA), якое валодае высокай гербіцыднай актыўнасцю без негатыўнага ўплыву на рост клетак HeLa.Мы таксама выявілі, што вытворныя урмотоновой кіслаты парушаюць мікратрубачкі раслін;акрамя таго, KAND ўплывае на ніткі актыну і выклікае гібель клетак;Гэтыя шматгранныя эфекты адрозніваюцца ад эфектаў вядомых інгібітараў мікратрубачак і мяркуюць новы механізм дзеяння урсонавай кіслаты, што з'яўляецца важнай перавагай пры распрацоўцы новых гербіцыдаў.
Адкрыццё і практычнае прымяненне карысных натуральных прадуктаў і іх вытворных з'яўляецца сродкам паляпшэння якасці жыцця чалавека.Другасныя метабаліты, якія ўтвараюцца мікраарганізмамі, раслінамі і насякомымі, прывялі да сур'ёзных дасягненняў у медыцыне і сельскай гаспадарцы.Многія антыбіётыкі і лекі супраць лейкеміі былі распрацаваны з натуральных прадуктаў.Акрамя таго, розныя відыпестыцыды, фунгіцыды і гербіцыды здабываюцца з гэтых натуральных прадуктаў для выкарыстання ў сельскай гаспадарцы.У прыватнасці, гербіцыды для барацьбы з пустазеллем з'яўляюцца важнымі інструментамі для павышэння ўраджайнасці ў сучаснай сельскай гаспадарцы, і розныя тыпы злучэнняў ужо выкарыстоўваюцца ў камерцыйных мэтах.Некалькі клеткавых працэсаў у раслінах, такіх як фотасінтэз, метабалізм амінакіслот, сінтэз клеткавай сценкі, рэгуляцыя мітозу, сігналізацыя фітагармонаў або сінтэз бялку, лічацца тыповымі мішэнямі гербіцыдаў.Злучэнні, якія інгібіруюць функцыю мікратрубачак, з'яўляюцца агульным класам гербіцыдаў, якія ўплываюць на рост раслін шляхам уплыву на рэгуляцыю мітазу2.
Мікратрубачкі з'яўляюцца кампанентамі цыташкілета і шырока захаваны ў эукарыятычных клетках.Гетэрадымер тубуліну складаецца з α-тубуліну і β-тубуліну, якія ўтвараюць лінейныя пратафіламенты мікратрубачак, прычым 13 пратафіламентаў утвараюць цыліндрычную структуру.Мікратрубачкі гуляюць розныя ролі ў раслінных клетках, у тым ліку вызначаюць форму клетак, дзяленне клетак і ўнутрыклеткавы транспарт3,4.Раслінныя клеткі ўтрымліваюць мікратрубачкі пад інтэрфазнай плазматычнай мембранай, і, як мяркуюць, гэтыя так званыя коркавыя мікратрубачкі кантралююць арганізацыю мікрафібрыл цэлюлозы праз рэгуляцыю комплексаў цэлюлозасінтазы4,5.Кортыкальныя мікратрубачкі клетак каранёвага эпідэрмісу, прысутныя ў зоне хуткага падаўжэння кончыка кораня, размешчаны латэральна, а цэлюлозныя микроволокна ідуць за гэтымі микротрубочками і абмяжоўваюць кірунак пашырэння клетак, тым самым спрыяючы анізатропнай элангацыі клетак.Такім чынам, функцыя мікратрубачак цесна звязана з марфалогіяй раслін.Амінакіслотныя замены ў генах, якія кадуюць тубулін, выклікаюць перакос каркавых масіваў мікратрубачак і лева- ці правабаковы рост у Arabidopsis 6,7.Падобным чынам мутацыі ў звязаных з мікратрубачкамі бялках, якія рэгулююць дынаміку мікратрубачак, таксама могуць прывесці да парушэння росту каранёў8,9,10,11,12,13.Акрамя таго, апрацоўка гербіцыдамі, якія разбураюць мікратрубачкі, такімі як дызапірамід, таксама вядомы як прэтылахлор, таксама выклікае левабаковы касы рост каранёў14.Гэтыя дадзеныя паказваюць, што дакладнае рэгуляванне функцыі мікратрубачак мае вырашальнае значэнне для вызначэння напрамку росту раслін.
Былі адкрыты розныя тыпы інгібітараў мікратрубачак, і гэтыя прэпараты ўнеслі значны ўклад у даследаванні цыташкілета, а таксама ў сельскую гаспадарку і медыцыну2.У прыватнасці, арызалін, злучэнні дынітрааніліну, дызапірамід, роднасныя бензаміду злучэнні і іх аналагі могуць інгібіраваць функцыю мікратрубачак і тым самым душыць рост раслін.Таму іх шырока выкарыстоўваюць у якасці гербіцыдаў.Аднак, паколькі мікратрубачкі з'яўляюцца важным кампанентам клетак раслін і жывёл, большасць інгібітараў мікратрубачак з'яўляюцца цітатоксічнымі для абодвух тыпаў клетак.Такім чынам, нягледзячы на іх агульнапрызнаную карысць у якасці гербіцыдаў, у практычных мэтах выкарыстоўваецца абмежаваная колькасць сродкаў супраць мікратрубачак.
Streptomyces - род сямейства Streptomyces, які ўключае аэробныя грамположительные ніткападобныя бактэрыі і шырока вядомы сваёй здольнасцю вырабляць шырокі спектр другасных метабалітаў.Таму ён лічыцца адным з найважнейшых крыніц новых біялагічна актыўных натуральных прадуктаў.У цяперашнім даследаванні мы выявілі новае злучэнне пад назвай кумаманамід, якое было вылучана з Streptomyces werraensis MK493-CF1 і S. werraensis ISP 5486. З дапамогай спектральнага аналізу і поўнага спектральнага аналізу была ахарактарызавана структура кумамонаміду і яго унікальны N-алкаксіпірольны шкілет быў вызначаны.сінтэз.Было ўстаноўлена, што урмоновая кіслата, сінтэтычны прамежкавы прадукт урсманааміду і яго вытворных, інгібіруе рост і прарастанне папулярнай мадэльнай расліны Arabidopsis thaliana.У даследаванні ўзаемасувязі структура-актыўнасць мы выявілі, што злучэнне з С9, мадыфікаваным да урсоновой кіслаты, называецца нонилоксивытворным урсоновой кіслаты (KAND), значна ўзмацняе інгібіруючы эфект на рост і прарастанне.Характэрна, што нядаўна адкрыты інгібітар росту раслін таксама паўплываў на рост тытуню і печеночника і не быў цітотоксіческой для бактэрый або клетак HeLa.Больш за тое, некаторыя вытворныя урмотоновой кіслаты выклікаюць скажоны фенатып кораня, маючы на ўвазе, што гэтыя вытворныя прама ці ўскосна ўплываюць на мікратрубачкі.У адпаведнасці з гэтай ідэяй нашы назіранні за мікратрубачкамі, пазначанымі імунагістахімічна або флуарэсцэнтнымі вавёркамі, паказваюць, што лячэнне KAND дэпалімерызуе мікратрубачкі.Акрамя таго, лячэнне вытворнымі кумамотоновой кіслаты парушала микрофиламенты актыну.Такім чынам, мы выявілі новы інгібітар росту раслін, унікальны механізм дзеяння якога ўключае разбурэнне цыташкілета.
Штам MK493-CF1 быў вылучаны з глебы ў Сінагава-ку, Токіо.Штам MK493-CF1 ўтвараў добра разгалінаваны стромальных міцэліем.Вызначана частковая паслядоўнасць гена 16S рыбасомнай РНК (1422 пн).Гэты штам вельмі падобны на S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: тыповы штам, 99,93%).На падставе гэтага выніку было ўстаноўлена, што гэты штам цесна звязаны з тыпавым штамам S. werraensis.Таму мы часова назвалі гэты штам S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T таксама вырабляе тыя ж біялагічна актыўныя злучэнні.Паколькі ранніх даследаванняў па атрыманні натуральных прадуктаў з гэтага мікраарганізма было мала, былі праведзены далейшыя хімічныя даследаванні.Пасля вырошчвання S. werraensis MK493-CF1 на асяроддзі ячменю шляхам цвёрдафазнай ферментацыі пры 30 ° C на працягу 14 дзён сераду экстрагавалі 50% EtOH.60 мл пробы сушылі з атрыманнем 59,5 мг сырога экстракта.Сырой экстракт падвергнулі ВЭЖХ з зваротнай фазай з атрыманнем N-метокси-1Н-пиррол-2-карбоксамида (1, названага кумамонамидом, 36,0 мг).Агульная колькасць 1 складае прыкладна 60% сырога экстракта.Таму мы вырашылі дэталёва вывучыць ўласцівасці кумамотоамида 1.
Кумамонамід 1 уяўляе сабой белы аморфны парашок, і маса-спектраметрыя высокага раздзялення (HRESIMS) пацвярджае C6H8N2O2 (мал. 1).С2-замешчаны пірольны фрагмент гэтага злучэння характарызуецца δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Гц, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH у спектры ЯМР 1H: 4,5 Гц , H-5) і δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Гц, H-6), а спектр ЯМР 13C паказвае прысутнасць чатырох атамаў вугляроду sp2.Наяўнасць аміднай групы ў становішчы C2 ацэньвалася па карэляцыі HMBC ад пратона C-3 да карбанільнага вугляроду аміду пры δC 161,1.Акрамя таго, пікі ЯМР 1 H і 13 C пры δH 4,10 (3H, S) і δC 68,3 паказваюць на прысутнасць N-метаксільных груп у малекуле.Хоць правільнае становішча метоксигруппы яшчэ не было вызначана з дапамогай спектраскапічнага аналізу, такога як узмоцненая рознічная спектраскапія і ядзерная абрэвіятура Оверхаўзера (NOEDF), N-метокси-1Н-пиррол-2-карбоксамид стаў першым злучэннем-кандыдатам.
Каб вызначыць правільную структуру 1, быў выкананы поўны сінтэз (мал. 2а).Апрацоўка камерцыйна даступнага 2-амінапірыдыну 2 m-CPBA прывяла да адпаведнага N-аксіду 3 з колькасным выхадам.Пасля 2-амінаазідавання 2 рэакцыя цыклакандэнсацыі, апісаная Абрамовічам, была праведзена ў бензоле пры 90°C з атрыманнем патрэбнага 1-гідраксі-1Н-пірол-2-карбанітрылу 5 у грамах.Хуткасць 60% (два этапы).15,16.Метыляванне і гідроліз 4 затым далі 1-метаксі-1Н-пірол-2-карбонавую кіслату (называецца "кумотоновая кіслата", 6) з добрым выхадам (70%, дзве стадыі).Нарэшце, амідаванне праз прамежкавы хлораксід кіслаты з выкарыстаннем воднага аміяку дало амід Кумамота 1 з выхадам 98%.Усе спектральныя дадзеныя сінтэзаванага 1 былі падобныя на ізаляваны 1, таму структура 1 была вызначана;
Агульны сінтэз і аналіз біялагічнай актыўнасці урбенаміду і урбенавай кіслаты.(а) Поўны сінтэз аміду Кумамота.(b) Сямідзённыя саджанцы дзікага тыпу Arabidopsis Columbia (Col) вырошчвалі на пласцінах Murashige і Skoog (MS), якія змяшчалі кумамонамід 6 або кумамонамід 1 у паказаных канцэнтрацыях.Маштаб = 1 см.
Спачатку мы ацанілі біялагічную актыўнасць урбенаміду і яго прамежкавых прадуктаў на прадмет іх здольнасці мадуляваць рост раслін.Мы дадалі розныя канцэнтрацыі урсмонамида 1 або урсмоновой кіслаты 6 у агаровое асяроддзе MS і культывавалі на гэтым асяроддзі расаду Arabidopsis thaliana.Гэтыя аналізы паказалі, што высокія канцэнтрацыі (500 мкМ) 6 інгібіруюць рост каранёў (мал. 2b).Затым мы стварылі розныя вытворныя, замяніўшы пазіцыю N1 на 6, і правялі на іх даследаванні ўзаемасувязі структура-дзейнасць (працэс аналагавага сінтэзу апісаны ў Дапаможнай інфармацыі (SI)).Саджанцы Arabidopsis вырошчвалі на асяроддзі, якая змяшчае 50 мкМ вытворных урсоновой кіслаты, і вымяралі даўжыню кораня.як паказана на малюнку.Як паказана на малюнках 3a, b і S1, кумама-кіслоты маюць розную даўжыню лінейных алкаксільных ланцугоў (9, 10, 11, 12 і 13) або вялікіх алкаксільных ланцугоў (15, 16 і 17) у становішчы N1.Вытворныя паказалі значнае тармажэнне росту каранёў.Акрамя таго, мы выявілі, што прымяненне 200 мкм 10, 11 або 17 інгібіруе прарастанне (мал. 3c і S2).
Вывучэнне ўзаемасувязі структура-актыўнасць аміду Кумамота і роднасных злучэнняў.(а) Будова і схема сінтэзу аналагаў.(Б) Колькасная ацэнка даўжыні кораня 7-дзённых саджанцаў, выгадаваных на асяроддзі MS з або без 50 мкМ вытворных кумамонамида.Зорачкі паказваюць істотныя адрозненні ад фіктыўнага лячэння (t тэст, с<0,05).n>18. Дадзеныя паказаны як сярэдняе ± SD.nt азначае «не праверана», таму што больш за 50% насення не прараслі.(С) Колькасная ацэнка хуткасці прарастання апрацаваных насення, инкубированных на працягу 7 дзён у асяроддзі MS з або без 200 мкМ кумамонамида і роднасных злучэнняў.Зорачкі паказваюць істотныя адрозненні ад фіктыўнага лячэння (крытэрый хі-квадрат).n=96.
Цікава, што даданне алкільных бакавых ланцугоў, даўжэйшых за C9, зніжае інгібіруючую актыўнасць, што сведчыць аб тым, што злучэнням, звязаным з кумамотавай кіслатой, для праявы біялагічнай актыўнасці патрэбныя бакавыя ланцугі пэўнага памеру.
Паколькі аналіз ўзаемасувязі структура-актыўнасць паказаў, што C9 быў мадыфікаваны ў урсонавую кіслату, а нонілаксівытворнае урсонавай кіслаты (далей KAND 11) было найбольш эфектыўным інгібітарам росту раслін, мы правялі больш дэталёвую характарыстыку KAND 11. Лячэнне Arabidopsis з 50 мкм KAND 11 амаль цалкам прадухіляў прарастанне, у той час як больш нізкія канцэнтрацыі (40, 30, 20 або 10 мкм) KAND 11 інгібіравалі рост каранёў у залежнасці ад дозы (мал. 4а, б).Каб праверыць, ці ўплывае KAND 11 на жыццяздольнасць каранёвай мерыстэмы, мы даследавалі каранёвыя мерыстэмы, афарбаваныя ёдыдам пропідыю (PI) і вымералі памер плошчы мерыстэмы.Памер мерыстэмы праросткаў, выгадаваных на асяроддзі, якая змяшчае 25 мкМ KAND-11, склаў 151,1 ± 32,5 мкм, у той час як памер мерыстэмы праросткаў, вырашчаных на кантрольнай асяроддзі, якая змяшчае ДМСО, склаў 264,7 ± 30,8 мкм (мал. 4в, г) , што паказвае на тое, што KAND-11 аднаўляе клеткавую актыўнасць.распаўсюджванне.Каранёвая мерыстэма.У адпаведнасці з гэтым лячэнне KAND 11 паменшыла колькасць сігналу маркера клеткавага дзялення CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS у каранёвай мерыстэме (мал. 4e) 17 .Гэтыя вынікі паказваюць, што KAND 11 інгібіруе рост каранёў шляхам зніжэння актыўнасці праліферацыі клетак.
Аналіз інгібіруе эфекту вытворных урбеноновой кіслаты (урбенилоксипроизводных) на рост.(а) 7-дзённыя сеянцы дзікага тыпу Col, вырашчаныя на пласцінах MS з указанымі канцэнтрацыямі KAND 11. Шкала = 1 см.(Б) Колькасная ацэнка даўжыні кораня.Літары паказваюць істотныя адрозненні (Тэст HSD у Турцыі, с<0,05).n>16. Дадзеныя паказаны як сярэдняе ± SD.(С) Канфакальнай мікраскапія афарбаваных ёдыдам пропидия каранёў Col дзікага тыпу, вырашчаных на пласцінах MS з або без 25 мкМ KAND 11. Белыя дужкі паказваюць каранёвую мерыстэму.Шкала = 100 мкм.(D) Колькасная ацэнка памеру каранёвай мерыстэмы (n = ад 10 да 11).Статыстычныя адрозненні былі вызначаны з дапамогай t-крытэрыю (с<0,05).Палоскі адлюстроўваюць сярэдні памер мерыстэмы.(Е) Дыферэнцыяльная інтэрферэнцыйная кантрасная (ДВС) мікраскапія каранёвай мерыстэмы, якая змяшчае канструкцыю CDKB2;1pro: CDKB2;1-GUS афарбаваны і афарбаваны на 5-дзённых саджанцах, вырашчаных на пласцінах MS з або без аналізу 25 мкМ KAND.
Фітатаксічнасць KAND 11 была дадаткова праверана з выкарыстаннем іншай двухдольнай расліны, тытуню (Nicotiana tabacum), і асноўнага мадэльнага арганізма наземнай расліны, пячоначніцы (Marchantia polymorpha).Як і ў выпадку з Arabidopsis, расада тытуню SR-1, выгадаваная на асяроддзі, якая змяшчае 25 мкМ KAND 11, дала больш кароткія карані (мал. 5а).Акрамя таго, 40 з 48 насення прараслі на пласцінах, якія змяшчаюць 200 мкМ KAND 11, у той час як усе 48 насення прараслі на фіктыўна апрацаваных асяроддзях, што паказвае на тое, што больш высокія канцэнтрацыі KAND былі значнымі (p<0,05;тэст хі -квадрат) перашкаджае прарастанню тытуню.(Мал. 5б).Акрамя таго, канцэнтрацыя KAND 11, якая інгібіравала рост бактэрый у печеночнике, была аналагічная эфектыўнай канцэнтрацыі ў Arabidopsis (мал. 5c).Гэтыя вынікі паказваюць, што KAND 11 можа стрымліваць рост розных раслін.Затым мы даследавалі магчымую цытатаксічнасць злучэнняў, звязаных з моноамидом мядзведзя, у іншых арганізмах, а менавіта ў клетках HeLa чалавека і штаме Escherichia coli DH5α, як прадстаўніках клетак вышэйшых жывёл і бактэрый адпаведна.У серыі аналізаў клеткавай праліферацыі мы заўважылі, што кумамонамид 1, кумамонамидная кіслата 6 і KAND 11 не ўплываюць на рост клетак HeLa або E. coli пры канцэнтрацыях 100 мкМ (мал. 5d,e).
Інгібіравання росту KAND 11 у не-Arabidopsis арганізмаў.(а) Двухтыднёвую расаду тытуню дзікага тыпу SR-1 вырошчвалі на вертыкальна размешчаных пласцінах MS, якія змяшчаюць 25 мкМ KAND 11. (б) Двухтыднёвую расаду тытуню дзікага тыпу SR-1 вырошчвалі на гарызантальна размешчаных Пласціны MS, якія змяшчаюць 200 мкМ KAND 11. (c) Двухтыднёвыя ныркі дзікага тыпу пячоначніцы Tak-1, выгадаваныя на пласцінах Gamborg B5 з указанымі канцэнтрацыямі KAND 11. Чырвоныя стрэлкі паказваюць спрэчкі, якія спынілі рост на працягу двух тыдняў інкубацыі. перыяд.(D) Аналіз праліферацыі клетак HeLa.Колькасць жыццяздольных клетак вымяралі праз фіксаваныя прамежкі часу з дапамогай набору для падліку клетак 8 (Dojindo).У якасці кантролю клеткі HeLa апрацоўвалі 5 мкг/мл актынаміцыну D (Act D), які інгібіруе транскрыпцыю РНК-палімеразы і выклікае гібель клетак.Аналізы праводзілі ў трох паўторах.(Е) Аналіз праліферацыі клетак E. coli.Рост кішачнай палачкі аналізавалі шляхам вымярэння OD600.У якасці кантролю клеткі апрацоўвалі 50 мкг/мл ампіцыліну (Amp), які інгібіруе сінтэз клеткавай сценкі бактэрый.Аналізы праводзілі ў трох паўторах.
Каб расшыфраваць механізм дзеяння цытатаксічнасці, выкліканай урамідападобнымі злучэннямі, мы паўторна прааналізавалі вытворныя урбенавай кіслаты з умераным інгібіруючым эфектам.як паказана на малюнку.Як паказана на малюнках 2b, 6a, расада, вырашчаная на агаравых пласцінах, якія змяшчаюць высокія канцэнтрацыі (200 мкМ) урматанавай кіслаты 6, давала больш кароткія і загнутыя ўлева карані (θ = – 23,7 ± 6,1), у той час як расада, выгадаваная на кантрольнай асяроддзі, сеянцы давалі амаль прамыя карані (θ = – 3,8 ± 7,1).Вядома, што гэты характэрны касой рост з'яўляецца вынікам дысфункцыі корковых микротрубочек14,18.У адпаведнасці з гэтым адкрыццём, прэпараты, якія дэстабілізуюць мікратрубачкі, дызапірамід і арызалін выклікалі падобны нахіл каранёў у нашых умовах росту (мал. 2b, 6a).У той жа час мы пратэставалі вытворныя урмотоновой кіслаты і адабралі некалькі з іх, якія ў пэўных канцэнтрацыях выклікалі касой рост каранёў.Злучэнні 8, 9 і 15 змянілі кірунак росту каранёў пры 75 мкМ, 50 мкМ і 40 мкМ адпаведна, паказваючы, што гэтыя злучэнні могуць эфектыўна дэстабілізаваць мікратрубачкі (мал. 2b, 6a).Мы таксама пратэставалі найбольш магутнае вытворнае урсолавай кіслаты, KAND 11, пры больш нізкай канцэнтрацыі (15 мкМ) і выявілі, што прымяненне KAND 11 інгібіруе рост каранёў і што кірунак росту каранёў быў нераўнамерным, хаця яны мелі тэндэнцыю да нахілу налева ( Малюнак C3)..Паколькі больш высокія канцэнтрацыі прэпаратаў, якія дэстабілізуюць мікратрубачкі, часам тармозяць рост раслін, а не выклікаюць нахіл каранёў, пасля мы ацанілі магчымасць таго, што KAND 11 уплывае на мікратрубачкі, назіраючы за коркавымі мікратрубачкамі ў клетках каранёвага эпідэрмісу.Імунагістахімія з выкарыстаннем антыцелаў да β-тубуліну ў клетках эпідэрмісу каранёў расады, апрацаваных 25 мкМ KAND 11, паказала знікненне амаль усіх коркавых мікратрубачак у клетках эпідэрмісу ў зоне падаўжэння (мал. 6b).Гэтыя вынікі паказваюць, што кумамотоновая кіслата і яе вытворныя прама ці ўскосна дзейнічаюць на мікратрубачкі, разбураючы іх, і што гэтыя злучэнні з'яўляюцца новымі інгібітарамі мікратрубачак.
Урсоновая кіслата і яе вытворныя змяняюць коркавыя мікратрубачкі ў Arabidopsis thaliana.(А) Кут нахілу кораня, вымераны ў прысутнасці розных вытворных урмотоновой кіслаты ў паказаных канцэнтрацыях.Таксама былі прааналізаваны эфекты двух злучэнняў, якія інгібіруюць мікратрубачкі: дызапіраміду і орызаліна.На ўрэзцы паказаны стандарт, які выкарыстоўваецца для вымярэння кута росту каранёў.Зорачкі паказваюць істотныя адрозненні ад фіктыўнага лячэння (t тэст, с<0,05).n>19. Маштаб = 1 см.(Б) Кортикальные микротрубочек ў клетках эпідэрмісу ў зоне падаўжэння.Мікратрубачкі ў каранях Arabidopsis Col дзікага тыпу, вырашчаных на пласцінах MS з або без 25 мкМ KAND 11, візуалізавалі з дапамогай імунагістахімічнага афарбоўвання з выкарыстаннем першасных антыцелаў да β-тубуліну і кан'югаваных з Alexa Fluor другасных антыцелаў.Шкала = 10 мкм.(С) Мітатычная структура мікратрубачак каранёвай мерыстэмы.Микротрубочек візуалізавалі з дапамогай иммуногистохимического афарбоўвання.Мітатычныя структуры, уключаючы профазныя зоны, верацяны і фрагмапласты, падлічвалі з канфакальных малюнкаў.Стрэлкамі паказаны структуры мітатычных мікратрубачак.Зорачкі паказваюць істотныя адрозненні ад фіктыўнага лячэння (t тэст, с<0,05).n>9. Шкала = 50 мкм.
Нягледзячы на тое, што Ursa валодае здольнасцю парушаць функцыю мікратрубачак, чакаецца, што механізм яго дзеяння будзе адрознівацца ад тыповых агентаў для дэпалімерызацыі мікратрубачак.Напрыклад, больш высокія канцэнтрацыі дэпалімерызатараў мікратрубачак, такіх як дызапірамід і арызалін, выклікаюць анізатропнае пашырэнне клетак эпідэрмісу, у той час як KAND 11 гэтага не робіць.Акрамя таго, сумеснае прымяненне KAND 11 і дизопирамида прывяло да камбінаванай рэакцыі росту каранёў, выкліканай дизопирамидом, і інгібіравання росту, выкліканага KAND 11 (мал. S4).Мы таксама прааналізавалі рэакцыю гіперчуллівага мутанта дызапіраміду 1-1 (phs1-1) на KAND 11. phs1-1 мае некананічную кропкавую мутацыю тубулінкіназы і стварае больш кароткія карані пры апрацоўцы дызапірамідам9,20.phs1-1 мутант расады, выгадаваныя на агаризованном асяроддзі, якая змяшчае KAND 11 былі больш кароткія карані, падобныя на тыя, якія выраслі на disopyramid (мал. S5).
Акрамя таго, мы назіралі мітатычныя структуры мікратрубачак, такія як профазныя зоны, верацяны і фрагмапласты, у каранёвай мерыстэме расады, апрацаванай KAND 11. У адпаведнасці з назіраннямі для CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, значнае зніжэнне назіралася колькасць митотических микротрубочек (мал. 6в).
Каб ахарактарызаваць цитотоксичность KAND 11 пры субклеточном дазволе, мы апрацавалі суспензію клетак тытуню BY-2 KAND 11 і назіралі за іх рэакцыяй.Спачатку мы дадалі KAND 11 да клетак BY-2, якія экспрэсуюць TagRFP-TUA6, які флуарэсцэнтна пазначае мікратрубачкі, каб ацаніць уплыў KAND 11 на коркавыя мікратрубачкі.Шчыльнасць коркавых мікратрубачак ацэньвалі з дапамогай аналізу малюнкаў, які колькасна вызначаў працэнт цыташкілетных пікселяў сярод цытаплазматычных пікселяў.Вынікі аналізу паказалі, што пасля апрацоўкі 50 мкМ або 100 мкМ KAND 11 на працягу 1 гадзіны шчыльнасць значна знізілася да 0,94 ± 0,74% або 0,23 ± 0,28% адпаведна, у той час як шчыльнасць клетак, апрацаваных ДМСО, склала 1,61 ± 0,34. % (мал. 7а).Гэтыя вынікі супадаюць з назіраннем у Arabidopsis, што лячэнне KAND 11 выклікае деполимеризацию корковых микротрубочек (мал. 6b).Мы таксама даследавалі лінію BY-2 з ніткамі актыну, пазначанымі GFP-ABD, пасля апрацоўкі той жа канцэнтрацыяй KAND 11 і заўважылі, што лячэнне KAND 11 разбурае ніткі актыну.Апрацоўка 50 мкм або 100 мкм KAND 11 на працягу 1 ч значна зніжала шчыльнасць ніткі актыну да 1,20 ± 0,62% або 0,61 ± 0,26%, адпаведна, у той час як шчыльнасць у клетках, апрацаваных ДМСО, складала 1,69 ± 0,51% (мал. 2).7б).Гэтыя вынікі кантрастуюць з эфектамі прапізаміду, які не ўплывае на ніткі актыну, і латрункуліна B, дэпалімерызатара актыну, які не ўплывае на мікратрубачкі (SI, малюнак S6).Акрамя таго, лячэнне кумамонамідам 1, кумамонаміднай кіслатой 6 або KAND 11 не паўплывала на мікратрубачкі ў клетках HeLa (SI, малюнак S7).Такім чынам, мяркуецца, што механізм дзеяння KAND 11 адрозніваецца ад механізму дзеяння вядомых разбуральнікаў цыташкілета.Акрамя таго, наша мікраскапічнае назіранне за клеткамі BY-2, апрацаванымі KAND 11, выявіла пачатак гібелі клетак падчас лячэння KAND 11 і паказала, што доля мёртвых клетак, афарбаваных у сіні колер Эванса, істотна не павялічылася пасля 30 хвілін лячэння KAND 11, у той час як пасля 90 хвілін апрацоўкі 50 мкМ або 100 мкМ KAND колькасць мёртвых клетак павялічылася да 43,7% або 80,1% адпаведна (мал. 7с).У сукупнасці гэтыя дадзеныя паказваюць, што новае вытворнае урсоловой кіслаты KAND 11 з'яўляецца спецыфічным для раслін інгібітарам цыташкілета з раней невядомым механізмам дзеяння.
KAND ўплывае на коркавыя мікратрубачкі, актынавыя ніткі і жыццяздольнасць клетак тытуню BY-2.(А) Візуалізацыя корковых микротрубочек ў клетках BY-2 у прысутнасці TagRFP-TUA6.Клеткі BY-2, апрацаваныя KAND 11 (50 мкМ або 100 мкМ) або ДМСО, даследавалі з дапамогай канфакальнай мікраскапіі.Шчыльнасць коркавых микротрубочек разлічвалі па мікрафатаграфіі 25 незалежных клетак.Літары паказваюць істотныя адрозненні (Тэст HSD у Турцыі, с<0,05).Шкала = 10 мкм.(Б) коркавыя ніткі актыну ў клетках BY-2, візуалізаваныя ў прысутнасці GFP-ABD2.Клеткі BY-2, апрацаваныя KAND 11 (50 мкМ або 100 мкМ) або ДМСО, даследавалі з дапамогай канфакальнай мікраскапіі.Шчыльнасць кортикальных нітак актыну была разлічана па мікрафатаграфіі 25 незалежных клетак.Літары паказваюць істотныя адрозненні (Тэст HSD у Турцыі, с<0,05).Шкала = 10 мкм.(С) Назіранне за мёртвымі клеткамі BY-2 шляхам афарбоўвання сінім Эванса.Клеткі BY-2, апрацаваныя KAND 11 (50 мкМ або 100 мкМ) або ДМСО, даследавалі з дапамогай мікраскапіі ў светлым полі.n=3.Шкала = 100 мкм.
Адкрыццё і прымяненне новых натуральных прадуктаў прывяло да значнага прагрэсу ў розных аспектах жыцця чалавека, у тым ліку ў медыцыне і сельскай гаспадарцы.Для атрымання карысных злучэнняў з прыродных рэсурсаў былі праведзены гістарычныя даследаванні.У прыватнасці, актынаміцэты, як вядома, карысныя ў якасці супрацьпаразітарных антыбіётыкаў для нематод з-за іх здольнасці вырабляць розныя другасныя метабаліты, такія як авермектын, галоўнае злучэнне івермектыну і блеаміцыну і яго вытворныя, якія выкарыстоўваюцца ў медыцыне як супрацьракавы агент 21,22.Акрамя таго, мноства гербіцыдных злучэнняў было выяўлена з актынаміцэтаў, некаторыя з якіх ужо выкарыстоўваюцца ў камерцыйных мэтах1,23.Такім чынам, аналіз метабалітаў актынаміцэтаў для вылучэння натуральных прадуктаў з патрэбнай біялагічнай актыўнасцю лічыцца эфектыўнай стратэгіяй.У гэтым даследаванні мы выявілі новае злучэнне, кумаманамід, з S. werraensis і паспяхова сінтэзавалі яго.Урсоновая кіслата з'яўляецца сінтэтычным прамежкавым прадуктам урбенамида і яго вытворных.Ён можа выклікаць характэрнае скручванне каранёў, праяўляць ад сярэдняй да моцнай гербіцыдную актыўнасць і прама ці ўскосна пашкоджваць мікратрубачкі раслін.Аднак механізм дзеяння урмотоновой кіслаты можа адрознівацца ад механізму дзеяння існуючых інгібітараў мікратрубачак, паколькі KAND 11 таксама разбурае ніткі актыну і выклікае гібель клетак, што сведчыць аб механізме рэгулявання, з дапамогай якога урмотоновая кіслата і яе вытворныя ўплываюць на шырокі спектр структур цыташкілета..
Далейшая дэталёвая характарыстыка урбеноновой кіслаты дапаможа лепш зразумець механізм дзеяння урбеноновой кіслаты.У прыватнасці, наступная мэта складаецца ў тым, каб ацаніць здольнасць урсоновой кіслаты звязвацца з адноўленымі мікратрубачкамі, каб вызначыць, ці дзейнічае урсоновая кіслата і яе вытворныя непасрэдна на мікратрубачкі і дэпалімерызуе іх, ці іх дзеянне прыводзіць да дэстабілізацыі мікратрубачак.Акрамя таго, у выпадку, калі мікратрубачкі не з'яўляюцца прамой мішэнню, вызначэнне месца дзеяння і малекулярных мішэняў урсоновой кіслаты на клетках раслін дапаможа ў далейшым зразумець ўласцівасці роднасных злучэнняў і магчымыя спосабы паляпшэння гербіцыднай актыўнасці.Наш аналіз біялагічнай актыўнасці выявіў унікальную цітотоксіческой здольнасць урсоновой кіслаты на рост такіх раслін, як Arabidopsis thaliana, тытунь і печеночник, пры гэтым ні E. coli, ні клеткі HeLa не былі закрануты.Малая таксічнасць для клетак жывёл з'яўляецца перавагай вытворных урсоновой кіслаты, калі яны распрацоўваюцца ў якасці гербіцыдаў для выкарыстання на адкрытых сельскагаспадарчых палях.Сапраўды, паколькі мікратрубачкі з'яўляюцца агульнымі структурамі ў эукарыёт, іх селектыўнае інгібіраванне ў раслінах з'яўляецца ключавым патрабаваннем да гербіцыдаў.Напрыклад, прапізамід, дэпалімерызатар мікратрубачак, які непасрэдна звязваецца з тубулінам і інгібіруе полімерызацыю, выкарыстоўваецца ў якасці гербіцыду з-за яго нізкай таксічнасці для клетак жывёл24.У адрозненне ад дизопирамида, роднасныя бензамиды валодаюць іншай спецыфікай прыцэла.У дадатак да мікратрубачак раслін RH-4032 або бензаксамід таксама інгібіруе мікратрубачкі клетак жывёл або оомицетов адпаведна, а заліламід выкарыстоўваецца ў якасці фунгіцыду з-за яго нізкай фітатаксічнасці25,26,27.Нядаўна знойдзены мядзведзь і яго вытворныя дэманструюць выбарчую цытатаксічнасць супраць раслін, але варта адзначыць, што далейшыя мадыфікацыі могуць змяніць іх спецыфічнасць да мэты, патэнцыйна забяспечваючы дадатковыя вытворныя для барацьбы з патагеннымі грыбамі або оомицетами.
Унікальныя ўласцівасці урбенонавай кіслаты і яе вытворных карысныя для іх распрацоўкі ў якасці гербіцыдаў і выкарыстання ў якасці даследчых інструментаў.Важнасць цыташкілета ў кантролі формы расліннай клеткі шырока прызнана.Больш раннія даследаванні паказалі, што расліны развілі складаныя механізмы арганізацыі коркавых мікратрубачак, кантралюючы дынаміку мікратрубачак, каб правільна кантраляваць марфагенез.Выяўлена вялікая колькасць малекул, якія адказваюць за рэгуляцыю актыўнасці мікратрубачак, і адпаведныя даследаванні ўсё яшчэ працягваюцца3,4,28.Наша сучаснае разуменне дынамікі мікратрубачак у раслінных клетках не цалкам тлумачыць механізмы арганізацыі коркавых мікратрубачак.Напрыклад, хаця і дызапірамід, і арызалін могуць дэпалімерызаваць мікратрубачкі, дызапірамід выклікае сур'ёзнае дэфармаванне каранёў, у той час як арызалін аказвае адносна слабы эфект.Больш за тое, мутацыі ў тубуліне, які стабілізуе мікратрубачкі, таксама выклікаюць правае паварот у каранях, у той час як паклітаксел, які таксама стабілізуе дынаміку мікратрубачак, не выклікае.Такім чынам, вывучэнне і ідэнтыфікацыя малекулярных мішэняў урсоловой кіслаты павінна даць новае ўяўленне аб рэгуляцыі корковых мікратрубачак раслін.Сапраўды гэтак жа будучае параўнанне хімічных рэчываў, якія эфектыўныя ў стымуляванні скажонага росту, такіх як дызапірамід, і менш эфектыўных хімічных рэчываў, такіх як арызалін або кумамоторная кіслата, дасць падказкі, як адбываецца скажаны рост.
З іншага боку, звязаныя з абаронай перабудовы цыташкілета - яшчэ адна магчымасць растлумачыць цитотоксичность урсоновой кіслаты.Заражэнне ўзбуджальнікам або ўкараненне элісітара ў раслінныя клеткі часам выклікае разбурэнне цыташкілета і наступную гібель клетак29.Напрыклад, паведамлялася, што крыптаксанцін, атрыманы з оомицетов, разбурае мікратрубачкі і ніткі актыну да гібелі клетак тытуню, падобна таму, што адбываецца пры лячэнні KAND30,31.Падабенства паміж ахоўнымі рэакцыямі і клеткавымі рэакцыямі, выкліканымі урсонавай кіслатой, прывяло нас да здагадкі, што яны запускаюць агульныя клеткавыя працэсы, хоць відавочны больш хуткі і моцны эфект урсонавай кіслаты, чым крыптаксантыну.Аднак даследаванні паказалі, што разбурэнне нітак актыну спрыяе спантаннай гібелі клетак, што не заўсёды суправаджаецца разбурэннем мікратрубачак29.Акрамя таго, яшчэ трэба высветліць, ці выклікае альбо ўзбуджальнік, альбо элісітар скажоны рост каранёў, як гэта робяць вытворныя урсонавай кіслаты.Такім чынам, малекулярныя веды, якія звязваюць ахоўныя рэакцыі і цыташкілет, з'яўляюцца прывабнай праблемай, якую трэба вырашыць.Выкарыстоўваючы прысутнасць злучэнняў з нізкай малекулярнай масай, звязаных з урсоновой кіслатой, а таксама шэрагу вытворных з рознай магутнасцю, яны могуць даць магчымасць нацэліцца на невядомыя клеткавыя механізмы.
У сукупнасці адкрыццё і прымяненне новых злучэнняў, якія мадулююць дынаміку мікратрубачак, дадуць магутныя метады разгляду складаных малекулярных механізмаў, якія ляжаць у аснове вызначэння формы расліннай клеткі.У гэтым кантэксце нядаўна распрацаванае злучэнне urmotonic acid, якое ўплывае на мікратрубачкі і ніткі актыну і выклікае гібель клетак, можа даць магчымасць расшыфраваць сувязь паміж кантролем мікратрубачак і гэтымі іншымі механізмамі.Такім чынам, хімічны і біялагічны аналіз з выкарыстаннем урбенонавай кіслаты дапаможа нам зразумець малекулярныя рэгулятарныя механізмы, якія кантралююць цыташкілет раслін.
Прышчапіце S. werraensis MK493-CF1 у колбу Эрленмейера аб'ёмам 500 мл, якая змяшчае 110 мл пасяўной асяроддзя, якая складаецца з 2% (вага/аб'ём) галактозы, 2% (вага/аб'ём) пасты Essence, 1% (вага/аб'ём) складу Bacto .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (вага/аб'ём) экстракт кукурузы (KOGOSTCH Co., Ltd., Японія), 0,2% (вага/аб'ём) (NH4)2SO4 і 0,2% CaCO3 у дэіянізаванай вадзе.(РН 7,4 да стэрылізацыі).Насенныя культуры інкубавалі на ратацыйнай качалцы (180 абаротаў у хвіліну) пры 27 ° С на працягу 2 дзён.Вырошчванне вытворчасці шляхам цвёрдафазнай ферментацыі.Пасяўную культуру (7 мл) пераносілі ў колбу K-1 аб'ёмам 500 мл, якая змяшчае 40 г вытворчай асяроддзя, якая складаецца з 15 г прэсаванага ячменю (MUSO Co., Ltd., Японія) і 25 г дэіянізаванай вады (рн не адрэгуляваны). перад стэрылізацыяй).).Закісанне праводзяць пры 30°С у цемры на працягу 14 дзён.Матэрыял ферментацыі экстрагавалі 40 мл/бутэлька EtOH і центрифугировали (1500 g, 4°C, 10 хвілін).Супернатант культуры (60 мл) экстрагируют сумессю 10% MeOH/EtOAc.Арганічны пласт упаривают пры паніжаным ціску з атрыманнем астатку (59,5 мг), які падвяргаюць ВЭЖХ з градыентным элюированием (0-10 хвілін: 90%) на калонцы са зваротнай фазай (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 мкм, ID 10 мм × даўжыня 250 мм) H2O/CH3CN, 10–35 хвілін: ад 90% H2O/CH3CN да 70% H2O/CH3CN (градыент), 35–45 хвілін: 90% H2O/EtOH, 45–155 хвілін: 90% H2O /EtOH да 100% EtOH (градыент (градыент), 155-200 мін: 100% EtOH) пры хуткасці патоку 1,5 мл / мін, кумамонамид (1, 36,0 мг) вылучаюць у выглядзе белага аморфнага парашка.
Кумамотаамід (1);1Н-ЯМР (500 МГц, CDCl3) δ 6,93 (т, J = 2,5 Гц, 1Н), 6,76 (дд, J = 4,3, 1,8 Гц, 1Н), 6,05 (т, J = 3,8 Гц, 1Н).), 4,08 (с, 3Н);13C-ЯМР (125 МГц, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ разлічанае значэнне: 141,0659, вымеранае значэнне: 141,0663, ІЧ-максімум 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 см–1.
Насенне калумбіі (Col-0) былі атрыманы з Цэнтра біялагічных рэсурсаў Arabidopsis (ABRC) з дазволам на даследчае выкарыстанне.Насенне Col-0 размножвалі і падтрымлівалі ў нашых лабараторных умовах і выкарыстоўвалі як расліны арабідопсісу дзікага тыпу.Насенне арабідопсісу павярхоўна стэрылізавалі і культывавалі ў асяроддзі Мурасіге і Скуга з напалову трываласцю, якая змяшчае 2% цукрозы (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (маса/аб'ём) 2-(4-марфоліна)этансульфонавай кіслаты (MES) ( Fujifilm Wako Pure Chemical ).) і 1,5% агару (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, пры 23 °C і пастаянным святле.Насенне мутанта phs1-1 былі прадастаўлены Т. Хашымота (Нарскі інстытут навукі і тэхналогій).
Насенне штаму SR-1 былі прадастаўлены Т. Хасімота (Нарскі інстытут навукі і тэхналогій) і выкарыстоўваліся ў якасці раслін дзікага тыпу тытуню.Насенне тытуню павярхоўна стэрылізавалі і замочвалі ў стэрыльнай вадзе на тры ночы, каб спрыяць прарастанню, затым змяшчалі ў раствор напалову, які змяшчае 2% цукрозы, 0,05% (вага/аб'ём) MES і 0,8% геллановой камедзі (Fujifilm Wako Pure Chemical) Мурасігэ.і асяроддзе Скуга) з рн 5,7 і інкубуюць пры 23°C пры пастаянным асвятленні.
Штам Tak-1 быў прадастаўлены T. Kohchi (Універсітэт Кіёта) і быў выкарыстаны ў якасці стандартнай эксперыментальнай адзінкі для даследавання печеночника.Gemma была атрымана са стэрылізаваных культурных раслін, а затым высаджана на асяроддзе Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical), якое змяшчае 1% цукрозы і 0,3% геллановой камедзі, і інкубавана пры 23°C пры бесперапынным асвятленні.
Клеткі тытуню BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) былі прадастаўлены S. Hasezawa (Такійскі універсітэт).Клеткі BY-2 разводзілі ў 95 разоў у мадыфікаванай асяроддзі Лінсмайера і Скуга і штотыдзень дабаўлялі 2,4-дыхлорфенаксіуксусную кіслату 32 .Клеткавую завісь змешвалі на ратацыйны шейкере пры 130 аб / мін пры 27 ° С у цемры.Прамыйце клеткі свежай асяроддзем, большым у 10 разоў, і ресуспендируйте ў той жа асяроддзі.Трансгенныя клетачныя лініі BY-2, якія стабільна экспрэсуюць маркер мікратрубачак TagRFP-TUA6 або маркер ніткі актыну GFP-ABD2 пад промоторам 35S віруса мазаікі каляровай капусты, былі створаны, як апісана 33,34,35.Гэтыя клетачныя лініі можна падтрымліваць і сінхранізаваць з дапамогай працэдур, падобных да тых, што выкарыстоўваліся для зыходнай клетачнай лініі BY-2.
Клеткі HeLa культывавалі ў мадыфікаванай Дульбека асяроддзі Ігла (DMEM) (Life Technologies), дабаўленай 10% фетальной бычынай сыроваткі, 1,2 ЕД/мл пеніцыліну і 1,2 мкг/мл стрэптаміцыну ў інкубатары пры 37°C з 5% CO2.
Усе эксперыменты, апісаныя ў гэтай рукапісы, праводзіліся ў адпаведнасці з японскімі правіламі і рэкамендацыямі па біябяспецы.
Злучэнні растваралі ў дыметилсульфоксиде (ДМСО; Fujifilm Wako Pure Chemical) у якасці асноўных раствораў і разводзілі ў асяроддзі MS для Arabidopsis і тытуню або ў асяроддзі Gamborg B5 для печеночника.Для аналізу інгібіравання росту каранёў больш за 10 насення на пласціну высейвалі на агаризованное асяроддзе, якое змяшчае ўказаныя злучэнні або ДМСО.Насенне інкубавалі ў роставай камеры на працягу 7 дзён.Расаду фатаграфавалі і вымяралі даўжыню каранёў.Для аналізу прарастання Arabidopsis 48 насення на пласціну высейвалі на агаризованное асяроддзе, якое змяшчае 200 мкМ злучэння або ДМСО.Насенне арабідопсісу вырошчвалі ў роставай камеры і падлічвалі колькасць прарослых сеянцоў праз 7 дзён пасля прарастання (даг).Для аналізу прарастання тытуню 24 насення на пласціну высейвалі на агаровую сераду, якая змяшчае 200 мкМ KAND або DMSO.Насенне тытуню вырошчвалі ў роставай камеры і праз 14 дзён падлічвалі колькасць прарослых праросткаў.Для аналізу інгібіравання росту пячоначнай травы 9 эмбрыёнаў з кожнай пласціны высаджвалі на агаровую сераду, якая змяшчае паказаныя канцэнтрацыі KAND або DMSO, і інкубавалі ў камеры росту на працягу 14 дзён.
Выкарыстоўвайце саджанцы, афарбаваныя 5 мг/мл прапідыю ёдыду (PI), каб візуалізаваць арганізацыю каранёвай мерыстэмы.Сігналы PI назіралі з дапамогай флуарэсцэнтнай мікраскапіі з выкарыстаннем канфакальнага лазернага сканавальнага мікраскопа TCS SPE (Leica Microsystems).
Гистохимическое афарбоўванне каранёў β-глюкуронидазой (GUS) праводзілі ў адпаведнасці з пратаколам, апісаным Malami і Benfey36.Праросткі фіксавалі ў 90% ацэтоне на працягу ночы, афарбоўвалі 0,5 мг/мл 5-бром-4-хлор-3-індаліл-β-d-глюкуронавай кіслаты ў буферы GUS на працягу 1 гадзіны і змяшчалі ў гідратаваны раствор хлоральдэгіду.(8 г хлоралгидрата, 2 мл вады і 1 мл гліцэрыны) і назіралі з дапамогай дыферэнцыяльнай інтэрферэнцыйнай кантраснай мікраскапіі з выкарыстаннем мікраскопа Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Каранёвыя куты вымяралі на 7-дзённых праростках, выгадаваных на вертыкальна размешчаных пласцінах.Вымерайце вугал кораня ад напрамку вектара гравітацыі, як апісана ў кроку 6.
Размяшчэнне корковых микротрубочек назіралася, як апісана, з нязначнымі мадыфікацыямі ў пратаколе 37.Анты-β-тубулінавыя антыцелы (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) і Alexa Fluor 488-кан'югаваныя анты-мышыныя IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) выкарыстоўваліся ў якасці першасных і другасных антыцелаў у развядзенні 1:1000 і 1:100, адпаведна.Флуарэсцэнтныя выявы былі атрыманы з дапамогай канфакальнага лазернага сканавальнага мікраскопа TCS SPE (Leica Microsystems).Атрымлівайце выявы Z-стэка і стварайце праекцыі максімальнай інтэнсіўнасці ў адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы.
Аналіз праліферацыі клетак HeLa праводзіўся з выкарыстаннем набору для падліку клетак 8 (Dojindo) у адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы.
Рост E. coli DH5α аналізавалі шляхам вымярэння шчыльнасці клетак у культуры з дапамогай спектрафатометра пры 600 нм (OD600).
Арганізацыю цыташкілета ў трансгенных клетках BY-2 назіралі з дапамогай флуарэсцэнтнага мікраскопа, абсталяванага прыладай канфакальнага сканавання CSU-X1 (Yokogawa) і камерай sCMOS (Zyla, Andor Technology).Шчыльнасць цыташкілета ацэньвалася з дапамогай аналізу малюнкаў, які вызначаў колькасную долю пікселяў цыташкілета сярод пікселяў цытаплазмы ў канфакальных малюнках з выкарыстаннем праграмнага забеспячэння ImageJ, як апісана 38,39.
Для выяўлення гібелі клетак BY-2 аликвоту клетачнай завісі інкубавалі з 0,05% сінім Эванса на працягу 10 хвілін пры пакаёвай тэмпературы.Селектыўнае афарбоўванне сіняга Эванса мёртвых клетак залежыць ад экструзіі фарбавальніка з жыццяздольных клетак непашкоджанай плазматычнай мембранай40.Афарбаваныя клеткі назіралі з дапамогай светлавога мікраскопа (BX53, Olympus).
Клеткі HeLa вырошчвалі ў DMEM, дапоўненай 10% FBS, ва ўвільготненым інкубатары пры 37°C і 5% CO2.Клеткі апрацоўвалі 100 мкМ KAND 11, кумамонамовой кіслатой 6, кумамонамидом 1, 100 НГ/мл колцемида (Gibco) або 100 НГ/мл Nocodmaze (Sigma) на працягу 6 гадзін пры 37 ° С.Клеткі фіксавалі метанолам на працягу 10 хвілін, а затым ацэтатам на працягу 5 хвілін пры пакаёвай тэмпературы.Фіксаваныя клеткі інкубавалі з першасным антыцелам да β-тубуліну (1D4A4, Proteintech: 66240-1), разведзеным у 0,5% BSA/PBS, на працягу 2 гадзін, прамывалі 3 разы TBST, а затым інкубавалі з казінымі антыцеламі Alexa Fluor.488 1 гадзіна.– IgG мышы (Thermo Fisher Scientific: A11001) і 15 нг/мл 4',6-дыямідзіна-2-феніліндолу (DAPI), разведзеных у 0,5% BSA/PBS.Пасля трохразовага прамывання TBST афарбаваныя клеткі назіралі на інвертаваным мікраскопе Nikon Eclipse Ti-E.Выявы былі зроблены з астуджанай камерай Hamamatsu ORCA-R2 CCD з выкарыстаннем праграмнага забеспячэння MetaMorph (Molecular Devices).
Час публікацыі: 17 чэрвеня 2024 г